血清成分的生化分析-資料下載頁
2025-05-26 18:25本頁面
【正文】 將全部凝膠都傾入柱內(nèi) ， 當(dāng)液面接近凝膠面時 ，用螺旋夾將橡膠管夾緊 ， 然后小心放松螺旋夾 ， 使液體緩慢流出 （ 4～ 5d/m） ， 到液體剛好流入凝膠面時 ， 將螺旋夾再夾緊 ， 裝柱工作完成 。 加樣 用膠頭吸管將柱中上方清液吸出 ， 加入重鉻酸鉀和藍(lán)葡聚糖混合溶液 ， 用膠塞封住上口 。 洗脫 用生理鹽水洗脫液進行洗脫 。 打開螺旋夾 ， 使液體的流速達到 10～ 15d/m。 收集 混合液在凝膠柱中分離 ， 藍(lán)色的藍(lán)葡聚糖在下方 ， 黃色的重鉻酸鉀在上方 。 用試管收集流出藍(lán) 、 黃色液體 ， 比色并畫出洗脫曲線 。 實驗結(jié)果 例子 實際洗脫曲線 五、實驗結(jié)果 可通過凝膠過濾對樣品脫鹽 一、實驗原理 *鹽析分離所得之 γ 球蛋白，在進一步純化之前，先要將其中的硫酸銨除去。凝膠過濾法較之透析法是一種快速有效的方法。 *當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、硫酸銨混合物流經(jīng) Sephadex G25 柱時，硫酸銨滲入 Sephadex G25 內(nèi)部，而蛋白質(zhì)被排阻在外，因此，蛋白質(zhì)隨溶劑先流出，硫酸銨后流出。故能將二者分開。 二、操作方法 1．裝柱 *取層析柱 1根（ 20cm），垂直于固定架上，夾住流出口； *加 10ml磷酸鹽緩沖液（ mol/L， ）于柱中； *將溶脹好的 Sephadex G－ 25傾倒去水，加入磷酸鹽緩沖液（ ， ）并攪拌成懸浮液； *慢慢將凝膠裝入柱中，打開流出口； *繼續(xù)加入 SephadexG－ 25使自然沉降至 15cm高，關(guān)閉出口。 *打開出口，使柱中多余的磷酸鹽緩沖液流出至凝膠柱床面（切勿低于柱床面）； *用吸管吸取鹽析所得的蛋白質(zhì)溶液 2ml，沿管壁加入凝膠面上； *打開流出口，讓樣品進入凝膠柱； *再用滴管小心加入磷酸鹽緩沖液至離凝膠面2～ 3cm高； *接通裝有磷酸緩沖液的洗脫瓶開始洗脫； *調(diào)節(jié)流速為 ／ min，每 2ml收集 1管，編號，按順序放在試管架上。 （ 1） 在收集的同時，檢查蛋白質(zhì)是否流出： *于每管中取出 1滴放在黑色比色板孔中 (按編號順序）； *再分別加入 1滴 20％磺酰水楊酸，如出現(xiàn)白色沉淀即表示蛋白質(zhì)已流出凝膠柱； *如此再檢查到蛋白質(zhì)全流出為止。 （ 2）與此同時，檢測蛋白收集液中是否有硫酸銨： *再從含蛋白質(zhì)的管中取出 1滴于白色比色板中； *加入奈氏試劑 1滴，如蛋白管中不出現(xiàn)棕色，即表示蛋白質(zhì)中的硫酸銨已除去， （ 3）合并無硫酸銨的蛋白質(zhì)管，待用。
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