電泳圖譜的圖像分析及蛋白質(zhì)消化技術(shù)-資料下載頁
2025-05-26 13:27本頁面
【正文】 簡(jiǎn)單地測(cè)定完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量？？ MS儀器較少對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定的主要的三個(gè)原因： ① 盡管 MS儀器已經(jīng)相當(dāng)完善，但是儀器所進(jìn)行的測(cè)定仍然會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤。蛋白質(zhì)的質(zhì)量越大，絕對(duì)誤差越大 ② 不是所有的蛋白質(zhì)都能進(jìn)行完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量測(cè)定。MS對(duì)大分子蛋白質(zhì)和疏水蛋白質(zhì)很難進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定 ③ 完整蛋白質(zhì)質(zhì)量測(cè)定的靈敏度遠(yuǎn)低于肽質(zhì)量測(cè)定和肽串聯(lián) MS分析的靈敏度。 59 從 MS分析得到的肽段數(shù)據(jù)可直接與蛋白質(zhì)和核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。通過肽MS數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫信息的比較以鑒定蛋白質(zhì)。 某些 蛋白質(zhì)水解酶 在特定位點(diǎn)將蛋白質(zhì)切割成肽 。這一節(jié)討論可切割蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽提供 MS分析所用的酶及其方法 60 二、消化可以達(dá)到什么目的？ ? 理想的消化方法是在某些特定的氨基酸殘基上切割蛋白質(zhì)，產(chǎn)生最合適于 MS分析的片段。620氨基酸 的肽段對(duì) MS分析和數(shù)據(jù)庫比較理想。 ? 一般短于 6氨基酸的肽太短，不能在數(shù)據(jù)庫檢索中產(chǎn)生唯一的序列匹配。 ? 另一方面，在串聯(lián) MS分析中，很難從長(zhǎng)于20個(gè)氨基酸的肽段上獲得序列信息。 ? 因而蛋白質(zhì)消化的目標(biāo)是盡可能多的獲得合適長(zhǎng)度的肽段供 MS分析。 61 3. 蛋白酶介紹 ? 胰蛋白酶 ? GluC（ V8蛋白酶） ? 溴化氰 62 胰蛋白酶 ? 胰蛋白酶是蛋白質(zhì)組學(xué)分析中常用的蛋白酶 。胰蛋白酶在 賴氨酸和精氨酸 殘基位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)。但若在賴氨酸或精氨酸的 C端方向有脯氨酸則不能切割 。 63 GluC（ V8蛋白酶） ? 是內(nèi)切蛋白酶，它在醋酸氨或碳酸氫氨緩沖液中切割谷氨酸殘基的羧基側(cè)，但在磷酸鈉緩沖液中切割谷氨酸和天冬氨酸。GluC的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與胰蛋白酶相比有明顯的不同切割專一性，這提高了得到蛋白質(zhì)互補(bǔ)肽片段的可能性。這對(duì)分析具有高賴氨酸和精氨酸區(qū)域的蛋白質(zhì)特別有用，這些區(qū)域能被胰蛋白酶充分切割產(chǎn)生沒有足夠序列信息的極短的肽段。 64 Data analysis of mass spectrumPMF 65 其他蛋白酶和切割試劑 ? 還有幾種酶也可以用于蛋白質(zhì)組分析。包括LysC、胰凝乳蛋白酶、 AspN和幾種“非專一性”蛋白酶。這些酶的切割專一性對(duì)大部分蛋白質(zhì)組分析 不理想。這些只在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)切割的酶產(chǎn)生幾個(gè)大片段。這些大片段在串聯(lián) MS分析中不能提供有用的序列信息。另一方面，胰凝乳蛋白酶切割太頻繁（能切割酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸位點(diǎn)），產(chǎn)生過多序列肽段的小肽。不過，當(dāng)一個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)序列，特別是在某些感興趣區(qū)域，不能產(chǎn)生令人滿意的胰蛋白酶太肽，可以選擇使用這些酶。 66 非專一性蛋白酶 ? 非專一蛋白酶也是蛋白質(zhì)消化中常用的酶，例如枯草桿菌細(xì)胞溶素蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K和鏈霉蛋白酶。這些酶或多或少地隨機(jī)切割蛋白質(zhì)產(chǎn)生多個(gè)重疊肽。由于專一性較差，消化必須在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行以防止消化的過快，產(chǎn)生多個(gè)重疊的優(yōu)點(diǎn)是能獲得較多的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù) 67 溴化氰 ? 常用的化學(xué)試劑是 溴化氰（ CNBr），它在 甲硫氨酸 位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)。 CNBr的反應(yīng)具有高度專一性，但是在大多數(shù)的蛋白質(zhì)中甲硫氨酸殘基含量較少， CNBr切割產(chǎn)生數(shù)量較少的大片段，這些大片段在串聯(lián) MS分析中不能產(chǎn)生有用序列。 68 4. 在凝膠中消化蛋白質(zhì) 1D或 2DSDSPAGE分離蛋白質(zhì)的消化通常使用的方法是 “ 在凝膠中 ” 消化。從凝膠中切出感興趣條帶或點(diǎn)，進(jìn)行脫色，然后用蛋白酶處理。酶進(jìn)入凝膠基質(zhì)，將蛋白質(zhì)消化成肽，然后通過漂洗將肽從凝膠中洗脫。
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