酯酶與氧化酶ppt課件-資料下載頁
2025-05-26 00:30本頁面
【正文】 線粒體的標志酶之一 。是研究代謝旺盛細胞線粒體的有效手段。 心肌、腎小管上皮、胃壁細胞、肝細胞 活性均較高，惡性腫瘤 和癌前期酶活性有增高趨勢。 三、 DOPA氧化酶 (Catechol Oxidase) 也稱兒茶酚氧化酶，酪氨酸酶。 反應(yīng)原理 以 DOPA(dihydroxyphenylalanine, 二羥苯基丙氨酸）為底物，氧化后經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)生成黑色產(chǎn)物。 孵育液 ，溶于 酸緩沖液中， 。 3. 操作步驟 (1) 新鮮組織，厚 5mm, 10%福爾馬林室溫固定 1h。 (2) 流水沖 3分； (3) 入孵育液， 37℃1h。 (4) 換孵育液， 37℃12 15h。 (5) 流水沖洗； (6) Bouin液固定 24h。 (7) 酒精脫水，透明，石蠟包埋； (8) 切片 68微米，可復(fù)染； (9) 樹膠封片。 4. 結(jié)果 酶活性部位呈 黑棕色顆粒 。 5. 對照 去底物或用氰化物 6. 生物學(xué)意義 對診斷惡性黑素瘤有意義。 四、單胺氧化酶 (Monoamine Oxidase, MAO) 又稱腎上腺素氧化酶，酪胺酶。 反應(yīng)原理 MAO是催化 芳香族、脂肪族單胺類 氧化脫氨基 的酶，屬黃素酶，以 FAD為輔基。反應(yīng)產(chǎn)物有醛和H2O2。利用它們的還原性或氧化性進行組化染色。 E F A D + R C H 2 N H 2 + H 2 O E F A D H 2 + R C H O +E F A D H 2 + O 2 E F A D + H 2 O 2N H 3反應(yīng)產(chǎn)物有醛和 H2O2，利用醛的還原性和 H2O2的氧化性進行組化染色。 (1) 醛還原作用 NC H2 C H 2 N H 2EF A DN H3 +NC H2C H OE F A D H 2NC H2C O O H吲哚乙胺吲哚乙醛吲哚乙酸四唑鹽： N B T甲簪藍紫顆粒氧化 氧化 還原 (2) H2O2的氧化作用 利用產(chǎn)生的 H2O2經(jīng)辣根過氧化物酶 (HRP)催化，將芳香胺氧化顯色。 CN NN NC L++ 2 HNNNNHC + H C L四唑鹽（無色） + H還原甲簪沉淀（藍紫色）HRP 2. 孵育液 —— 四唑鹽法 鹽酸色胺（底物） 25mg 無水硫酸鈉 4mg NBT（四唑鹽） 4mg () 5ml 蒸餾水 15ml 3. 操作步驟 (1)新鮮冰凍切片； (2)入孵育液， 37℃ 30 60min； (3)流水沖洗 2min； (4)4%多聚甲醛固定 24h。 (5)洗滌，脫水，甘油明膠封片。 4. 結(jié)果 酶反應(yīng)陽性部位見藍色或紫色甲簪顆粒。 5. 對照 去色胺底物。 6. 生物學(xué)意義： (1)含生物活性胺組織：腎上腺髓質(zhì)， APUD細胞 (2)參與毒性胺解毒組織：肝細胞、腎小管、腸粘膜上皮。 五、輔酶非依賴性脫氫酶－琥珀酸脫氫酶 (Succinate dehydrogenase, SDH) 反應(yīng)原理 —— 四唑鹽法 琥珀酸被 SDH氧化為延胡索酸，脫氫通過中間受氫體吩嗪甲基硫酸酯（ PMS)，把四唑鹽 (NBT)還原為二甲簪。 琥珀酸延胡索酸P M SP M S H二甲簪（蘭色）四唑鹽（ N B T ）S D H還原 2. 孵育液 TNBT（ 2,2’,5,5’四對硝基苯 3,3’氯化雙四唑） () 5ml 琥珀酸鈉 81mg 蔗糖 250mg 10ml 3. 操作步驟 (1)新鮮組織冰凍切片； (2)入孵育液 37℃,30min ； (3)PBS沖洗； (4)福爾馬林鈣固定 10min； (5)80%酒精洗 5min； (6)甘油明膠封固。 4. 結(jié)果 陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈細小紫藍色顆粒。 5. 對照 (1)去琥珀酸底物； (2)加 SDH競爭性抑制； (3)加熱使細胞內(nèi)酶失活。 6. 生物學(xué)意義 三羧酸循環(huán)標志酶 ；心、肝、腎豐富； 定位線粒體 。 六、輔酶依賴性脫氫酶－乳酸脫氫酶 （ Lactate dehydrogenase, LDH) 反應(yīng)原理 從反應(yīng)生成的 NADH，通過受氫體 PMS（吩嗪硫酸甲脂）供給四唑鹽，將其還原為甲簪。 N A D +++乳酸L D HN A D H + H + 丙酮酸鹽乳酸丙酮酸鹽N A DN A D HP M S HP M S四唑鹽甲簪+2. 孵育液 NBT 10mg () 8ml PMS吩嗪甲基硫酸酯 37 ℃ 溶解 1mg 4%乳酸鈉 2ml NAD+ 5mg 3. 操作步驟 (1)恒冷箱切片，吹干入孵液， 37℃,15min ，避光； (2)蒸水洗； (3)福爾馬林鈣固定 15分以上； (4)蒸水洗； (5)甘油明膠封片。 4. 對照 (1)去底物乳酸鈉 (2)去 NAD+ 5. 結(jié)果 酶活性部位呈紫藍色甲簪沉淀。 6. 生物學(xué)意義 凡能進行糖酵解的細胞都有此酶存在，細胞損傷可有此酶釋出。 有五種同工酶， MM3H M2H M1H H4，用聚丙酰胺凝膠電泳可將同工酶分離， M4主要存在于骨骼肌和肝臟 ， H4主要存在與心肌 。 小 結(jié) 酯酶 非特異性酯酶：顯示方法 乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶、脂酶顯示方法、原理及生物學(xué)意義 氧化酶 細胞色素氧化酶的顯示方法、原理和生物學(xué)意義 脫氫酶 琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶的顯示方法、原理及生物學(xué)意義。 酶組化小結(jié) 分類、條件、基本方法、影響酶活性的條件 磷酸酶金屬法、偶聯(lián)法原理、步驟及意義 ATP酶的分類與顯示方法 非特異性酯酶、特異性酯酶顯示方法及原理 細胞色素氧化酶和乳酸脫氫酶原理與方法
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