【正文】 ．B6．B 7．A 8．D 9．A 10．AX型題：1．ABCD 2．ABCE 3．ABDE二、名詞解釋1．聚合酶鏈反應(yīng)：PCR是利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在體外條件下，催化一對(duì)引物間的特異DNA片斷合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2．原位PCR：是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟片包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。3．RTPCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR是一種檢測RNA的方法。其原理是先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。4．反向PCR：是對(duì)已知DNA片斷兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究的一種方法。其原理是：用限制性內(nèi)切酶消化DNA片斷，然后用連接酶將酶切產(chǎn)物連接成環(huán)狀，再用已知序列上兩端相反方向的引物進(jìn)行PCR。5．多重PCR：是在一次反應(yīng)中加入多種引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中的不同序列。每對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物序列長短不一。根據(jù)不同長短的序列存在與否，檢測是否有某些基因片斷的缺失與突變。多重PCR對(duì)于檢測疾病相關(guān)基因十分龐大的疾病很有價(jià)值。6．巢式PCR：巢式PCR有兩對(duì)引物，一對(duì)引物對(duì)應(yīng)的序列在模板外測，稱外引物，另一對(duì)引物互補(bǔ)序列在同一模板的外引物的內(nèi)側(cè)，稱內(nèi)引物，即外引物擴(kuò)增產(chǎn)物較長，含有內(nèi)引物擴(kuò)增的靶序列，經(jīng)過二次PCR放大將單拷貝的目的DNA序列檢出。巢式PCR最大的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度大大提高7．不對(duì)稱PCR：不對(duì)稱PCR的目的是擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。PCR反應(yīng)中采用兩種不同濃度的引物，一般采用50～100：1比例，最初的10～15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當(dāng)?shù)蜐舛鹊囊锉幌谋M后，以后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物的延伸產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生大量單鏈DNA。因PCR反應(yīng)中使用二種引物濃度不同，因此稱為不對(duì)稱PCR。8．錨定PCR：錨定主要用于擴(kuò)增未知序列或未全知的序列。首先分離總RNA或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，與此poly(dG)相對(duì)應(yīng)的錨定引物為poly(dC)，為保證擴(kuò)增特異性，poly(dC)應(yīng)在十二聚以上，5′端還可帶上某些限制性酶序列或其他序列信息。9．熒光定量PCR：熒光定量PCR亦稱實(shí)時(shí)熒光PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)檢測整個(gè)PCR過程，獲得在線描述PCR過程的動(dòng)力學(xué)曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板核酸進(jìn)行定量分析的方法。10．循環(huán)閾值：循環(huán)閾值是在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。11．TaqMan探針：在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)有熒光淬滅基團(tuán)，如TAMRA等。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程，熒光信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。12．分子信標(biāo)：分子信標(biāo)探針是TaqMan探針的一種衍生方法。探針設(shè)計(jì)與TaqMan探針相似，只不過是探針5′和3′端的一小段核苷酸序列被設(shè)計(jì)成互補(bǔ)的，沒有與靶序列雜交時(shí)會(huì)形成發(fā)夾狀態(tài)，此時(shí)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)極端靠近，熒光幾乎完全淬滅。探針與靶序列雜交后，發(fā)夾展開，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，熒光得以恢復(fù)，熒光檢測系統(tǒng)即可接收到熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)13．LCR：連接酶鏈反應(yīng)又稱為連接酶擴(kuò)增反應(yīng)。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5′磷酸與另一相鄰鏈的3′羥基連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反應(yīng)。LCR擴(kuò)增對(duì)象不是目標(biāo)片段，而是由引物組成的探針，是一種探針擴(kuò)增技術(shù)。LCR需要兩對(duì)引物A、B和A′、B′，其中引物A與引物A′互補(bǔ)，引物B與引物B′互補(bǔ)。模板雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板鏈復(fù)性退火，復(fù)性后引物A和B′的3′端分別與引物B和A′的5′端相鄰。若引物與模板完全互補(bǔ)，在DNA連接酶的作用下，使得相鄰兩個(gè)引物A和B、A′和B′的5′磷酸與3′羥基形成磷酸二酯鍵而相連。連接產(chǎn)物變性后，又可作為引物的模板參加反應(yīng)，使擴(kuò)增呈指數(shù)增長，經(jīng)過變性復(fù)性（退火）連接的20～30個(gè)循環(huán)，檢測連接反應(yīng)的產(chǎn)物。三、問答題1．影響PCR反應(yīng)的因素有哪些？PCR反應(yīng)體系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需離子的反應(yīng)緩沖液，這些因素都對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。2．試證明Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。一般來說，第n次PCR循環(huán)的熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）等于背景信號(hào)強(qiáng)度（RB）加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度（即單位熒光強(qiáng)度RS與分子數(shù)目的乘積），用數(shù)學(xué)式表示如下： Rn = RB +XO（1+Ex）nRs 式中：Rn代表熒光信號(hào)強(qiáng)度 RB代表背景信號(hào)強(qiáng)度 Xo代表起始模板拷貝數(shù) Ex代表擴(kuò)增效率 Rs代表單位熒光強(qiáng)度 N代表循環(huán)次數(shù)當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ct時(shí)，則RT=RB+Xo（1+Ex）CtRs兩邊取對(duì)數(shù)，則lg（RTRB）=lgXo+Ct lg（1+Ex）+lgRs將其整理，則，+Ct=lgXo lg(RTRB)lgRs lg(1+Ex) lg(1+Ex)對(duì)每一個(gè)特定的PCR反應(yīng)來說,Ex、RT、RB、和Rs都是常數(shù)，所發(fā)Ct值與lgXo成反比，也就是說，Ct值與起始模板DNA的拷貝數(shù)（Xo）的對(duì)數(shù)成反比，起始DNA濃度每增一倍，Ct值減小一個(gè)循環(huán)。因此，Ct值的引入確保了實(shí)時(shí)熒光PCR定量的精確和嚴(yán)格。3．簡述bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)的原理。分枝DNA是人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段，在每個(gè)側(cè)鏈上都可以標(biāo)記可被激發(fā)的標(biāo)記物。以bDNA為基礎(chǔ)建立的連續(xù)放大DNA信號(hào)以檢測DNA的技術(shù)稱為分枝DNA信號(hào)放大系統(tǒng)。bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)包括四種雜交探針，即目標(biāo)探針、前放大體、 放大體和標(biāo)記探針。首先用親和素包被微孔，加入目標(biāo)探針，該組探針能與等檢核酸靶序列上不同區(qū)域互補(bǔ)，其5′端用生物素標(biāo)記，能與微孔中的親和素高度親和結(jié)合；再向微孔中加入待測標(biāo)本，目標(biāo)核酸與固定于微孔中的目標(biāo)探針結(jié)合；再加入前放大體，該組探針的一段能與目標(biāo)核酸的不同區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，另一段與放大體（即分枝DNA）的主鏈部分的序列互補(bǔ)結(jié)合，分枝DNA由主鏈和數(shù)十根寡核苷酸組成，每個(gè)分枝上都有標(biāo)記探針的雜交位點(diǎn)，由酶標(biāo)寡核苷酸組成的標(biāo)記探針與bDNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合，加入底物后最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測。利用bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)可在每個(gè)靶序列上結(jié)合60～300個(gè)酶分子，而且所有雜交反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，觀察到的信號(hào)與靶DNA的量成正比，可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線將靶DNA定量。4．PCR檢測技術(shù)有何臨床應(yīng)用。（1）PCR在病原微生物的檢測中的應(yīng)用；（2）PCR在遺傳病中的應(yīng)用；（3）PCR在腫瘤中的應(yīng)用；（4）其它方面的應(yīng)用：PCR技術(shù)除用于臨床診斷和治療外，還可用于DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系識(shí)別、法醫(yī)物證等。5．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)如何設(shè)置。由于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)是對(duì)靶核酸的指數(shù)倍擴(kuò)增過程，因而有大量的擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，這種擴(kuò)增產(chǎn)物極易對(duì)以后的新擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生“污染”，為防止這種污染的發(fā)生，就需要對(duì)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)分隔開的工作區(qū)域，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)以及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如果采用全自動(dòng)擴(kuò)增儀，后兩個(gè)區(qū)域可以合并。應(yīng)注意的是，各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各區(qū)的儀器設(shè)備包括工作服、鞋子、實(shí)驗(yàn)記錄本和筆等都必須專用，不得混淆。此外，上述四個(gè)工作區(qū)域內(nèi)還應(yīng)有固定于房頂?shù)淖贤鉄?，以便于工作后區(qū)域內(nèi)的空氣照射。6．如何保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)測定由一系列步驟組成，包括樣本收集、樣本處理（核酸提?。⒑怂釘U(kuò)增、產(chǎn)物檢測結(jié)果報(bào)告及解釋等。室內(nèi)質(zhì)量控制僅涉及樣本處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析等測定分析步驟，而室間質(zhì)量評(píng)價(jià)則除了監(jiān)測測定分析步驟外，還包括較大范圍的實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)，諸如樣本接收中的可靠性、結(jié)果報(bào)告及解釋等。QA則是覆蓋更廣范圍的活動(dòng)，包括樣本收集、結(jié)果報(bào)告和解釋等。核酸分子雜交技術(shù)一、 A型題：1． 要探知細(xì)胞內(nèi)某一蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，可以通過_______實(shí)現(xiàn)。A. Southern blot B. Northern blot C. Western blot D. 原位分子雜交2． 核酸的變性是_______。A. 一級(jí)結(jié)構(gòu)的斷裂 B. 二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞 C. 伴有共價(jià)鍵的斷裂 D. 是DNA的降解過程。3． 固相雜交不包括_______。A. Northern印跡雜交 B. 原位雜交 C. 吸附雜交 D. Southern印跡雜交4． 染色體原位雜交結(jié)果如圖所示羊水細(xì)胞間期核與112X和Y 染色體的DNA探針雜交。左圖顯示細(xì)胞核與13號(hào)染色體（綠）和21號(hào)染色體（紅）的探針雜交。右圖顯示細(xì)胞核與18號(hào)染色體（淺藍(lán)）、X染色體(綠)和Y染色體（紅）的探針雜交 。請(qǐng)根據(jù)該結(jié)果得出診斷為_______。A． 21三體B． 女性胎兒C． 染色體微缺失D． 正常男性胎兒5． 染色體原位雜交結(jié)果如下圖左圖：用13號(hào)染色體（綠）和21號(hào)染色體（紅）的探針與來自羊水的間期細(xì)胞雜交，右圖：用18號(hào)染色體（淺藍(lán)色）、X染色體（綠）和Y染色體(紅)的探針與羊水細(xì)胞雜交。針對(duì)該檢測結(jié)果判斷疾病為_______。A． 男性21三體B． 女性21三體C． DiGeorge綜合癥D． 正常胎兒6． 熒光原位雜交結(jié)果如下圖X染色體著絲粒探針（Xcen）， 根據(jù)該結(jié)果可診斷為_______。A. 染色體微缺失B. 21三體C. 男性胎兒D. 正常女性胎兒7． 熒光素FITC是_______。A． 異硫氰酸熒光素B． 四乙基羅達(dá)明C． 德克薩斯紅D． 吲哚二羧菁二、 B型題A. 著絲粒探針 B. 染色體涂抹探針 C. 基因座特異探針 D. 端粒重復(fù)序列探針1. 可用于中期及間期細(xì)胞，檢測染色體的非整倍性2. 可用于中期及間期細(xì)胞，檢測微缺失和微重復(fù)3. 可用于中期及間期細(xì)胞，檢測染色體的非整倍性和端粒微小末端重排4. 只能用于中期細(xì)胞，確定小標(biāo)識(shí)染色體或畸變5. 重復(fù)序列探針A. 固相雜交 B. 液相雜交 C. Western 印跡 D. FISH E. RxFISH6. 菌落原位雜交7. 斑點(diǎn)和狹縫雜交8. Southern印跡雜交9. Northern印跡雜交10. 復(fù)性速率液相雜交11. 吸附雜交12. 發(fā)光液相雜交13. 液相夾心雜交14. 原位雜交A. DNA的濃度 B. DNA的大小和復(fù)雜性 C. 溫度 D. 離子強(qiáng)度15. 影響DNA復(fù)性的因素16. 影響DNA變性的因素17. 影響核酸分子雜交的因素 三、 X型題1． 根據(jù)性質(zhì)及來源不同，核酸探針又可被分為A. 基因組DNA探針B. DNA探針C. RNA探針D. 寡核苷酸探針等2． 常用的核酸探針非放射性標(biāo)記物有A. 地高辛B. 生物素C. 酶D. 熒光素系統(tǒng)3． 常用的核酸探針熒光素標(biāo)記物有A． 異硫氰酸熒光素B． 四乙基羅達(dá)明C． 德克薩斯紅D． 吲哚二羧菁等4． 非放射性探針檢測方法有A． 直接法B． 間接免疫法C． 直接親合法D． 間接親合法等5． Southern印跡技術(shù)是A． 檢測RNA的核酸雜交技術(shù)B． 是以發(fā)明者的名字命名的C． 屬于固相雜交的范疇D． 可用于遺傳病的檢測6． Northern印跡技術(shù)是A． 檢測RNA的核酸雜交技術(shù)B． 是以發(fā)明者的名字命名的C． 屬于固相雜交的范疇D． 與Southern印跡雜交的方法類似，只是變性劑不同7． 核酸原位雜交是A． 核酸分子雜交技術(shù)與組織細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)合起來的一種雜交方法，B． 基本原理及探針的標(biāo)記方法與傳統(tǒng)核酸分子雜交技術(shù)相同C． 不能確定與探針互補(bǔ)的核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置D． 不需要將核酸從細(xì)胞中提取出來8． 熒光原位雜交的標(biāo)本A． 中期染色體B． 間期核C． 完整細(xì)胞或組織切片D． 最廣泛應(yīng)用的標(biāo)本是中期染色體9． 液相分子雜交包括A． 吸附雜交B． 發(fā)光液相雜交C． 液相夾心雜交D． 復(fù)性速率液相分子雜交四、 名詞解釋1． 核酸分子雜交2． 核酸探針3． Southern 印跡4． Northern 印跡5． Western 印跡6． 染色體原位雜交7． 重復(fù)序列探針8． 單一序列探針9． 全染色體涂抹探針10． 基因座特異探針11． 變性12． 復(fù)性13． 增色效應(yīng)14． 雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度15． 退火16． FISH17． RxFISH五、 問答題1. 原位雜交的基本原理2. 簡述原位雜交在臨床中的應(yīng)用。3. 簡述臨床診斷常用的FISH探針的類型及用途。4. 舉例說明FISH技術(shù)在分子診斷上的應(yīng)用。5. MFI