【正文】 larvae, and a tube worm ?? 第三節(jié) 菌種保藏 第二節(jié) 菌種的衰退、復壯與保藏 一、微生物菌種衰退的原因 1. 原因 一 是菌種保藏不妥 。 二是菌種生長的要求沒有得到滿足，或是遇到不利的條件，或是失去某些需要的條件； 三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生 回復突變 ，從而喪失新的特征的情況。 連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因，這是由于菌種經(jīng)常處于旺盛的生長狀態(tài)。 衰退菌株的特點：個體或群體特征發(fā)生變化；生產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長；抗不良環(huán)境能力降低。 概念 確?；蚧謴途N優(yōu)良性能的措施 （一）菌種的衰退 形態(tài)改變、生長慢、 抗逆性差、產(chǎn)量及質(zhì)量下降 表現(xiàn) 根源 內(nèi)因 菌種的遺傳物質(zhì)發(fā)生了負變 外因 傳代過多，條件不適宜 返回本節(jié) 2 防止菌種衰退的措施 菌種的分離 : 因為在菌種發(fā)生衰退的同時，并不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是經(jīng)過環(huán)境條件考驗的，具有更強的生產(chǎn)能力。 因此，對于已衰退的菌株采用 單細胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得單細胞所長成的菌落（ colony），再通過菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來形狀的菌株，甚至性能更好的菌株（ strain）。 如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進 行分離復壯。 如對芽孢桿菌 (Bacillus)， 可先將菌液用沸水處理幾分鐘，再用平板進行分離，從所剩下的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體。 如果遇到某些菌株即使進行單細胞分離，仍不能達到復壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達到復壯的目的。 如 (Aspergillus terricola)的產(chǎn)孢子能力下降，可適當提高培養(yǎng)溫度，恢復其能力。 同時通過實驗選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。 其它防 衰 措 施 ? 菌種的復壯 ? 提供良好的環(huán)境條件 ? 使用優(yōu)良的保存方法 ? 定期純化菌種 二 、 菌種的復壯 ? 通過分離達到復壯 :菌落純 /細胞純 在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)再分離，達到 —菌落純 采用單細胞或單孢子分離法達到 —細胞純 ? 通過寄主體達到復壯 : 對于寄生性微生物的退化菌株 ,將菌株接種到寄主細胞進行繁殖達到復壯。 三、菌種保藏（ strain preservation） 基本原理 ：根據(jù)菌種的生理、生化特點，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于休眠狀態(tài)。 要求： 維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡量使菌種保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。 保藏時首先選擇 優(yōu)良純菌種 ，最好是它們的休眠體如孢子（ spore）、芽孢 (gemma)等；其次是要創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，使菌體的代謝活動處于最低狀態(tài)，延長其保存期。 （一）菌種保藏 目的： 提高菌種存活率，減少菌種的變 異，保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。 原理： 根據(jù)菌種的生物生理、生化特點， 人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。 保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以達到降低其代謝活動，延長保存期的目的。 低溫 干燥 無氧 缺營養(yǎng) 不利 條件 返回本節(jié) （一）保藏目的及原理 ?目的 ?原理 創(chuàng)造不利于菌種生長的一切條件， 使其代謝處于休眠狀態(tài)。 使菌種 不生長 不死亡 不污染 不降低或不喪失其優(yōu)良性 以盡量延長使用時間 返回本節(jié) 保存方法： 應能較長期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同時也要考慮到方法本身的經(jīng)濟簡便。不同的菌種有不同的保存方法，以便長期保藏。 酵母菌 ：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保藏法。 霉菌： 斜面保藏法和沙土管保藏法。 細菌和放線菌 ：一般細菌以采用冷凍干燥保藏法為佳 。 放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏 。 短期可采用斜面保藏 。 保藏應注意的問題 ： 菌體狀態(tài)：休眠體 基質(zhì)：營養(yǎng)貧乏 操作過程： 不應對細胞造成傷害 菌種保藏的方法： 斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍干燥法、冷凍法、液態(tài)真空干燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。 （ 1）斜面保藏法： 在 4℃ 左右的冰箱保藏，每隔一定時間進行移植培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏，如此反復。 優(yōu)點： 方法簡單、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺點： 菌種仍有一定的強度的代謝活動條件，保存時間不長，傳代多，菌種容易變異。 適用菌種： 細菌、酵母、防線菌、霉菌 （二）常用保藏法 以母種形式保藏 特點 簡便 保藏時間短 易污染及退化 不適于草菇等菌類 斜面菌種置 4~6℃ 冰箱中（ 3~6個月） 返回本節(jié) 返回本節(jié) （ 2）礦物油保藏法 將生長好的斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層高于斜面末端 1cm，然后放于冰箱中保存。 適用菌種： 適用于除細菌外的其它菌種 無菌檢驗 ？ 注入種管 淹沒斜面約 1cm 礦油 處理 滅菌： 152kpa、 30min 去水： 40~50℃ 烘至無色透明 口堵膠塞 用時轉(zhuǎn)管再轉(zhuǎn)管 返回本節(jié) 返回本節(jié) （ 3）砂土管保藏法 利用土壤顆粒對微生物起保護作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。 適用菌種： 產(chǎn)孢子的微生物，對于一些對干燥敏感的細菌（奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌）以及酵母不適用。 （ 4）真空冷凍干燥法 先在菌懸液加入保護劑（如：脫脂牛奶、血清等）然后在較低溫度下使成凍結(jié)狀態(tài)，最后減壓抽干。 特點： 它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達一年至數(shù)十年之久，并且存活率高，變異率低。單使手續(xù)麻煩，需要一定的設(shè)備。 適用菌種： 對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。 ?（ 5）其他保藏方法 ? 冷凍法： 分低溫冷凍（－ 20 ℃ ）與超低溫冷凍（－ 196 ℃ ）兩種。適用于細菌、真菌、病毒等的保藏 ? 液態(tài)真空干燥法： 菌體在恒溫液態(tài)條件下進行真空干燥。適用于包括細菌、病毒，特別適用于冷凍干燥保藏效果不佳的菌種。 ? 瓊脂穿刺封口保藏法： 適用于不產(chǎn)孢子細菌的保藏 ? 曲法保藏： 將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的干燥器中，干燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。 ? 麥粒保藏法： 麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時，置通風、避光、干燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。 ? 無水硅膠保藏法： 將細胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，加入裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于干燥器內(nèi)，室溫或 4 ℃ 保藏。對于細菌和真菌效果都較好。 基因工程菌的保藏 ? 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的 、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子 。 質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需 。 ? 一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時 ， 生長速度會加快 。 ? 當培養(yǎng)基中加入抗生素時 ， 抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓 。 而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時 ， 抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào) 。 ? 我們建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中 。 國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu) ? 菌種是一個國家的重要資源，世界各國對菌種的保藏都極為重視。世界上有 700多家菌菌種保藏機構(gòu)，其中國際知識產(chǎn)權(quán)組織承認的法定的保藏機構(gòu)僅有 28家。 我國的微生物菌種保藏機構(gòu) ? 1）普通微生物菌種保藏管理中心（ CCGMC） ? 中科院微生物所，北京， ? 中科院武漢病毒研究所 ? 2）農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ ACCC） ? 中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，北京 （ ISF） ? 3）工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC） ? 中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究院，北京，（ IFFI） ? 4）醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（ CMCC） ? 中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京 ? 衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京 ? 中國醫(yī)學科學院病毒研究所 ? 5）抗生素菌種保藏管理中心（ CACC） ? 中國醫(yī)學科學學院抗生素研究所，北京 ? 四川抗生素工業(yè)研究所，成都 ? 華北制藥廠抗生素研究所，石家莊 ? 6）獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（ CVCC） ? 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所，北京 國外主要的微生物菌種保藏機構(gòu) ? 1）美國標準菌種收藏所（ ATCC） ? 2）美國冷泉港研究所（ CSH） ? 3）日本東京大學應用微生物研究所（ IAM） ? 4）日本東京科研化學有限公司（ KCC） ? 5）日本大阪發(fā)酵研究所（ IFO） ? 6）英國國立標準菌種收藏所（ NCTC） ? 7）美國國立衛(wèi)生研究所（ NIH） ? 8）美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部（ NRRL） ？？ 2022年 7月 6日消息，加拿大奎爾夫大學教授 T. Ryan Gregory將大腸桿菌培養(yǎng)皿中的細菌能夠 “ 幻化 ” 成骷髏形狀。