酵母表達(dá)系統(tǒng)ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 18:37本頁面
【正文】 復(fù)序列： rDNA 提供多個整合位點 B、缺陷型標(biāo)記基因： Leu2d 提高選擇壓力 C、抗性標(biāo)記； neo 提高選擇壓力 甲醇 酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體 表達(dá)載體類型 需要帶入 ATG 單位點 甲醇 酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體 表達(dá)載體類型 需要帶入 ATG 多位點 甲醇 酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體 信號肽： PHO1 甲醇 酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體 信號肽： MFα 甲醇 酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體 信號肽： MFα 標(biāo)記： Kan 甲醇 酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對策 載體穩(wěn)定性 基因劑量 整合位點 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信號 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性 1）載體穩(wěn)定性 同拷貝數(shù)時，整合型的比自主復(fù)制型的表達(dá)水平高 YRp型載體的穩(wěn)定化： 選擇 — 非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費時，整合位點不確定。 采用 YIp型載體 : 更易實現(xiàn)整合、整合位點清楚 2）基因劑量 外源基因表達(dá)存在基因劑量效應(yīng) 篩選多拷貝整合子 載體引入 G418/Zeocin抗性標(biāo)記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關(guān)，采用高 G418/Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。 體外串聯(lián)多個表達(dá)盒，直接獲多拷貝整合子 采用 YRp型載體穩(wěn)定化技術(shù)獲高拷貝整合子 構(gòu)建高拷貝整合型表達(dá)載體 3）整合位點 外源基因表達(dá)盒整合于 AOX/MOX或標(biāo)記基因處，均可高效表達(dá) 畢赤酵母中個別情況整合于 His4位點的比 AOX1位點的低 4）甲醇利用表型 在分泌表達(dá)情況下，甲醇慢生長型更利于表達(dá) 5） mRNA5’端 mRNA5’端非翻譯區(qū)（ UTR）的組成與長度 應(yīng)盡量與 AOX1/MOX的一致 應(yīng)盡量避免在 UTR區(qū)出現(xiàn) AUG和次級結(jié)構(gòu) 6）基因序列的 AT含量 AT含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的結(jié)構(gòu) 7）分泌信號 分泌表達(dá)效率與所用分泌信號高度相關(guān) 可采用釀酒酵母來源的 MFα、 PHO或 SUC等的信號肽，或野生型信號肽，但適用性要比較分析。 8）表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性 分泌表達(dá)時，胞外蛋白酶是要影響因素 降低培養(yǎng)基 pH值：蛋白酶在酸性條件下活性較低 培養(yǎng)基中添加蛋白水解產(chǎn)物：競爭性抑制 采用蛋白酶缺陷宿主株：如 SMD1168
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