【正文】 如鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物細(xì)胞的消化。 EDTA最適合消化傳代細(xì)胞，常與胰蛋白酶使用。 （ 1）向培養(yǎng)瓶中放入 1－ 5mm3大小的組織塊，加 5ml2022單位 /ml的膠原酶干液，最終濃度為 200單位 /ml， pH=。 （ 2 ） ℃ 水浴 4 － 48 小時(shí)，無(wú)需搖動(dòng)，中間可更換酶液一次。 （ 3 ）當(dāng)組織變軟，分散于瓶底時(shí)，輕輕震蕩即散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，小心倒出培養(yǎng)液。 （ 4 ） 800r/min 離心 5 分鐘，棄上清液，重新懸浮 BSS 溶液中，再離心一次。 （ 5 ）加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液。 細(xì)胞融合 ? 將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以 2： 1或 10： 1的比例混勻于 50ml錐形離心管內(nèi)， 1200rpm離心 7— 10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在 60秒鐘內(nèi)逐滴加入 50%的 PEG ，隨后靜置 90秒，再于 5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入 5－ 10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止 PEG的作用，再靜置 10分鐘。 HAT選擇系統(tǒng)－－基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ? HAT是含一定濃度 次黃嘌呤（ Hypoxanthine,H） 、 氨基喋呤（ Aminopterin， A ） 及 胸腺嘧啶核苷（ Thymidine， T） 的一種 選擇性培養(yǎng)基 ，其中三種成分與細(xì)胞 DNA合成有關(guān)。 ? DNA合成途徑有兩種 : 需兩種酶：胸腺嘧啶核苷激酶 TK酶 :（催化次黃嘌呤產(chǎn)生肌苷） 次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶 HGPRT酶 : （催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧胸苷酸） 主要途徑由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)而合成 DNA，葉酸是必不可少的媒介，參與嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻斷 FH2到 FH4合成。 基于 HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng) H（ Hypoxanthine次黃嘌呤）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體 A（ Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成 T（ Thymidine，胸腺嘧啶）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體 HGPRT酶缺陷型細(xì)胞株（長(zhǎng)期培養(yǎng)系） 不能在 HAT培養(yǎng)液中生長(zhǎng) 正常細(xì)胞 體外生存能力有限，最終也將死亡 融合細(xì)胞 最后，只有融合細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)液中存活 特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選 ? 通過(guò)選擇性培養(yǎng)后生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞?？扇∩锨逡海鶕?jù) 抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度 等具體情況來(lái)加以選擇。 ? 可溶性抗原 可采用放射免疫、免疫酶標(biāo)測(cè)定、間接血凝等方法測(cè)定。 ? 細(xì)胞抗原 可采用免疫熒光、 51Cr釋放試驗(yàn)、溶血空斑測(cè)定、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒等方法直接測(cè)定針對(duì)這些抗原的抗體。 利用培養(yǎng)基對(duì)單抗進(jìn)行鑒定的過(guò)程 ?ABSORBTION OF ANTIGEN ?BLOCKING ?PRIMARY ANTIBODY ?SECONDARY ANTIBODY ?SUBSTRATE 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。 在培養(yǎng)過(guò)程中，一般要加能釋放某些生長(zhǎng)因子促進(jìn)雜交瘤生長(zhǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。 方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。 1）誘生腹水 將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。 方法是將降植烷或石蠟油注入 Balb/c小鼠腹腔， ，7天后腹腔接種 3~5 10^6 雜交瘤細(xì)胞。 10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含 1~10mg單抗。 2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗 單抗的大規(guī)模生產(chǎn) 單克隆抗體的改造和應(yīng)用 ?單抗作為體內(nèi)體外 診斷試劑 在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等 ?單克隆抗體靶向制劑，治療癌癥等疾病 ?雜交人－鼠單克隆抗體 1 單抗作為體內(nèi)體外診斷試劑 ? 現(xiàn)在已經(jīng)有各種不同類型的單抗試劑合在市場(chǎng)出售，例如乙型肝炎的表面抗原，鐵蛋白、促絨毛膜性激素、促甲狀腺激素、癌癥、艾滋病等診斷試劑。 ? 用 同位素標(biāo)記的單抗 在特定的組織中成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸形的 體內(nèi)診斷 。 2 單克隆抗體靶向制劑 ? 1）藥物與單抗 直接偶聯(lián) ? 通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使藥物分子的氨基與抗體分子的羧基之間直接形成穩(wěn)定的酰胺鍵。 ? 利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。 ? 利用羰基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿，最后還原。 ? 這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。 ? 如： 1， 4－溴柔紅霉素與腫瘤細(xì)胞單抗形成的偶合物，對(duì)腫瘤有明顯的選擇性毒性。 ?2）藥物 通過(guò)小分子 與單抗連接 ? 通過(guò)一些小 分子交聯(lián)劑 ，把藥物分子上的某些基團(tuán)連接起來(lái)。 ? 小分子交聯(lián)劑：如 同型雙功能試劑 ，包括戊二醛、順烏頭酸酐、馬來(lái)酸酐、戊二酐；異型雙功能試劑 ： N－琥珀酰胺基－ 3－丙酸和寡肽等。 ? 順烏頭酸酐制成的最常用，在中性條件下較穩(wěn)定，在酸性條件下容易發(fā)生水解。這種靶向試劑與腫瘤的表面抗原結(jié)合后，會(huì)進(jìn)入溶酶體，在酸性環(huán)境下釋放藥物，而殺死腫瘤細(xì)胞。 ?3）藥物通過(guò) 大分子 與抗體相連 ?大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 ?總之，利用單抗試劑合可以作為靶向藥物，針對(duì)腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、各種病原體病等。 雜交人－鼠單克隆抗體 chimeric 鼠源抗體一般無(wú)法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，還可能引發(fā)人對(duì)鼠源抗體本身的免疫反應(yīng)。 在抗體中， Fc片段在抗體中的作用是激活機(jī)體免疫反應(yīng)。對(duì)鼠源抗體進(jìn)行改造，利用人源的 Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的 Fc的 DNA片段。嵌合抗體可以保留其目標(biāo)專一性，降低人的抗鼠反應(yīng)。 人源單克隆抗體 低免疫原性、高效性 方法 1：分離人 B細(xì)胞，使之與熒光標(biāo)記的抗原相結(jié)合，通過(guò)熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的 B細(xì)胞，并用 Epstein－ Barr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單抗。 方法 2：將人源免疫干細(xì)胞導(dǎo)入缺失大部分免疫細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，遇到抗原時(shí)，產(chǎn)生人源的抗體。 方法 3：將改造過(guò)的人的抗體基因?qū)胧笈咛ブ校茉诿庖吆蟮玫疆a(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠。 抗體融合蛋白 將抗體的可變區(qū)與一非抗體蛋白融合起來(lái)，使融合蛋白繼承有抗體分子的結(jié)合特異性。可以保留不同程度的抗體結(jié)合特異性和激發(fā)其他免疫反應(yīng)的能力。 抗體酶 ? 結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點(diǎn)，既可以起 酶促催化作用 ，又可以 起抗體的選擇性和專一性結(jié)合抗原的作用 。 ? 制備抗體酶的方法： ? 1）利用與過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)相類似的半抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗體酶。 ? 2）利用定向催化，即利用抗體的特異性和親和性使催化反應(yīng)的兩種底物按一定的構(gòu)象結(jié)合并定向，從而降低底物分子的自由度，反應(yīng)速度加快。 ? 3）對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體與催化基團(tuán)相連。 單鏈抗體 ? 在大腸桿菌的系統(tǒng)中，可以表達(dá) VL－銜接物－ VH的序列，產(chǎn)生單鏈抗體。 ? 單鏈 FV片段 :抗體體積小、免疫原性較低，滲透性好，用于實(shí)體腫瘤的診斷和治療。 ? 生物導(dǎo)彈 ：利用單鏈抗體序列接上一段藥物蛋白的編碼序列，表達(dá)后的蛋白可以根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，而達(dá)到專一性治療疾病的目的。 ? 雙功能抗體片段： 兩個(gè)抗原結(jié)合特異性不同的 Fab或 Fv片段通過(guò)二硫鍵連接起來(lái)，如一個(gè)結(jié)合腫瘤特異性抗原，一個(gè)結(jié)合殺傷性 T細(xì)胞，這樣識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞的功能可以統(tǒng)一在一個(gè)單鏈抗體分子上。 單克隆抗體在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 ? 單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。 ? 利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。 ? 單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。 ? 單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。 思考題 ? 1 簡(jiǎn)述 McAb制備過(guò)程及主要原理。 ? 2 為什麼要對(duì)鼠源性 McAb進(jìn)行改造使之人源化？ ? 3 制備單抗靶向制劑的主要方法有哪些？單抗靶向制劑有何實(shí)際意義？ ? 4 簡(jiǎn)述利用細(xì)胞工程制備人源性 McAb的方法有哪些？它們的優(yōu)勢(shì)與難點(diǎn)如何？ 本章結(jié)束 謝謝！