揚(yáng)州大學(xué)基因工程期末試題復(fù)習(xí)要點(diǎn)整理-資料下載頁(yè)
2025-04-24 22:25本頁(yè)面
【正文】 缺點(diǎn)：l 假陽(yáng)性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。l 工作量大。l 無(wú)法定量研究。l 擴(kuò)出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來(lái)越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；l 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；l 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。A．酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域（DNAbinging domain,BD），一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的、具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成其激活功能。不同來(lái)源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達(dá)。B．噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個(gè)外被蛋白基因中時(shí)，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個(gè)外源DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá)，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物（多肽或蛋白）的抗體，通過(guò)親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過(guò)基因擴(kuò)增，得到大量所要的目的基因。TDNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。216。 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。216。 建立突變體基因組文庫(kù)及野生型基因組文庫(kù).216。 用TDNA片段做probe篩選突變體文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。216。 用獲得的陽(yáng)性克隆篩選野生型基因組文庫(kù)，獲得野生型的陽(yáng)性克隆。216。 把陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測(cè)序分析。第七章 克隆基因的表達(dá)通過(guò)比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：242。全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架；242?；蚩寺”磉_(dá)系統(tǒng)成熟、完善；242。繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；242。被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：242。缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；242。缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；242。內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；242。周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：252。 具有強(qiáng)的受嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動(dòng)子252。 表達(dá)蛋白的翻譯后的加工和修飾252。 營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低252。 可高密度發(fā)酵252。 表達(dá)蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題（這個(gè)找不到，百度的）如何提高克隆基因的表達(dá)水平？1）、表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)；2）、提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；3）、密碼子偏愛(ài)性；4）、表達(dá)環(huán)境條件的優(yōu)化?？寺』蚰康牡鞍椎谋磉_(dá)的形式主要有哪些類型？表達(dá)蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結(jié)構(gòu)形態(tài)：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄模式上可分為哪兩種？表達(dá)系統(tǒng)常選用哪一種？其機(jī)理是什么？啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄模式上分為：組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)常選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子機(jī)理：指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。 表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子；終止子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）；篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn)克隆載體：篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn) 根據(jù)表達(dá)蛋白用途的不同，設(shè)計(jì)選擇基因的表達(dá)策略。（1）表達(dá)蛋白用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究 ——主要考慮保持蛋白質(zhì)原有的功能不變；表達(dá)策略：融合表達(dá)和直接表達(dá)（2）表達(dá)蛋白用作抗原——主要考慮表達(dá)蛋白的快速提純；表達(dá)策略：以包涵體形式合成目的蛋白和融合表達(dá)目標(biāo)蛋白（不用去除標(biāo)簽蛋白）（3）表達(dá)蛋白用作結(jié)構(gòu)研究——表達(dá)蛋白以天然可溶形式產(chǎn)生；表達(dá)時(shí)考慮因素：表達(dá)溫度（高溫促進(jìn)包涵體的形成）；表達(dá)水平（高表達(dá)促成包涵體的形成）；表達(dá)載體受體菌。第八章 植物基因工程什么叫轉(zhuǎn)基因植物？植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線主要包括哪些？利用DNA重組技術(shù)，在離體條件下對(duì)不同生物的DNA進(jìn)行加工，并按照人們的意愿和適當(dāng)?shù)妮d體重新組合，再將重組DNA轉(zhuǎn)入生物體或細(xì)胞內(nèi)，并使其在生物體內(nèi)或細(xì)胞中表達(dá)的植物。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線l 分離目的基因l 目的基因與恰當(dāng)?shù)妮d體DNA形成重組DNAl 重組DNA的擴(kuò)增l 目的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞l 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株l 轉(zhuǎn)基因植株的大規(guī)模種植外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男縔 物理方法：電擊法、基因槍法(biolistic)、顯微注射法、微激光束法Y 化學(xué)方法：PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法Y 生物學(xué)方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法運(yùn)用已學(xué)的知識(shí)，如何全面分析獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體（提示：包括外源基因是否整合，被插入位點(diǎn)分析，外源基因是否表達(dá)，表達(dá)量如何？等）對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)與鑒定的對(duì)象——報(bào)告基因——目的基因(1)基因組水平的檢測(cè)與鑒定（外源基因是否整合，被插入位點(diǎn)分析）：可以用PCR擴(kuò)增結(jié)合Southern Blotting進(jìn)行驗(yàn)證。(2)基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)水平的檢測(cè)與鑒定(外源基因是否表達(dá)):可用RTPCR法或者Northern Blotting。(3)基因的翻譯水平的檢測(cè)與鑒定（表達(dá)量）：可用Western Blotting或者ELISA。對(duì)報(bào)告基因來(lái)講，還可以利用報(bào)告基因的顯色或發(fā)光特性進(jìn)行選擇與 鑒定出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的可能原因分析。(1)位置效應(yīng)：指插入部位及其周圍序列對(duì)外源基因的影響(2)DNA甲基化：包括編碼序列和啟動(dòng)子的甲基化(3)重復(fù)序列誘發(fā)基因沉默：多拷貝串聯(lián)重復(fù)序列易引起外源基因的失活；(4)共抑制（cosuppression）：具有部分同源性的外源基因和植物內(nèi)源基因相互作用引起的沉默現(xiàn)象。
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