【導(dǎo)讀】根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。腸桿菌中不加標(biāo)記外源蛋白都會以不溶的包涵體形式表達(dá)。而pETcoco載體它引入了低拷貝控制元件，F(xiàn)附加。對細(xì)胞的毒害作用。當(dāng)我們需要大量表達(dá)時加入樹膠醛醣誘導(dǎo)trfA. 基因表達(dá)，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)就可以增加到25-50。底表達(dá)被進(jìn)一步抑制，質(zhì)粒可以更穩(wěn)定地存在。白酶缺陷型的，這包括有B834,BL21,BLR,Origami?因此在純化時可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株。另外它的衍生株BLR是recA. Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個細(xì)胞的IPTG量都是一致的，連續(xù)分布的時候，就會造成蛋白表達(dá)量極低，或者翻譯提前終止。Rosetta系列是來自BL21lacY1，所以它具。實(shí)驗(yàn)各有各的不幸。貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。反而會損害細(xì)胞的生長。生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選

　　

【正文】 ，且打算做 Western 的話），以及空白載體（誘導(dǎo)）和重組載體（不誘導(dǎo)） 2 個陰性對照，再加上誘導(dǎo)不同時間的表達(dá)結(jié)果。 Marker 用于判斷條帶大 小，標(biāo)準(zhǔn)品用于判斷 Western 體系包括抗體顯色劑和操作的可靠性，以及精確判斷大小；空白載體（誘導(dǎo)）負(fù)對照有助于判斷在非誘導(dǎo)條件下的本底表達(dá)；而重組載體（不誘導(dǎo)）負(fù)對照則有助于判斷誘導(dǎo)的效果以及排除誘導(dǎo)劑對宿主菌潛在的干擾，或者是區(qū)分細(xì)菌內(nèi)源和外源表達(dá)產(chǎn)物 ——偷懶可不是好習(xí)慣，會影響結(jié)果判斷。注意，接種表達(dá)和接種做感受態(tài)都類似，一定要用挑單克隆、加足量抗生素、過夜培養(yǎng)的新鮮菌液轉(zhuǎn)種最好，在篩選壓力下生長旺盛的種子液遠(yuǎn)比經(jīng)過 4℃ 保存的菌液要好得多，也許是因?yàn)楸４鏁r間長會導(dǎo)致抗生素失效部分細(xì)菌丟失質(zhì)粒或者其他變 化。反正就是一種經(jīng)驗(yàn)做法。 跑 SDSPAGE 的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在 100ng 左右；但是不能跟著做 Western 了。銀染的靈敏度在 ～ 1 ng；有錢還可以用 Sypro Red，靈敏度高還可以繼續(xù)做 Western。 WesternBlot 是蛋白質(zhì)定性和半定量的最通用的技術(shù) 。 23 在做過 Western Blot 仍沒有檢測到表達(dá)帶，那么就要開始進(jìn)行下一步的分析了。首先，看看載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，是否有因?yàn)槊盖羞B接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號。有時載體幾經(jīng)多個實(shí)驗(yàn)人員的周轉(zhuǎn)，反復(fù)插入片斷，或者是粘 端相同的不同酶切片斷之間的連接，會意外在啟動子后面帶入終止位點(diǎn)，特別是用到 XbaI 之類的酶要小心。然后要對測序結(jié)果進(jìn)行確定，確定插入的每個堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。還有個大家容易忽略的問題：就是要看基因中有沒有細(xì)菌不常用的密碼子 ——如果有，需要考慮換表達(dá)菌株。每種菌株都有自己獨(dú)特的設(shè)計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像 pET 系列就一定需要有 T7 RNA 聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采 用不同調(diào)控機(jī)制會使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過載體的調(diào)控方式再換。以 Novagen 為例，如果使用 BL21(DE3)表達(dá)不成功的話可以換 Rosetta 系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與 pET 相容的質(zhì)粒提供 AUA， AGG， AGA， CUA， CCC 和 GGA 的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時不明原因的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋镜妆磉_(dá)產(chǎn)物抑制。 沒有發(fā)現(xiàn)原則性錯誤之后，最簡單、快捷的就是 改變一下表達(dá)溫度、 IPTG 濃度。低溫、較長時間的表達(dá)有利于蛋白穩(wěn)定、融合表達(dá)， 24 低濃度的 IPTG 可以減少化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞的損傷。培養(yǎng)基中的葡萄糖可能會抑制表達(dá)。有時表達(dá)的蛋白可能比預(yù)期的有不同，要認(rèn)真研究電泳結(jié)果。如果嘗試改變條件后依然沒有表達(dá)，可以試試換不同的培養(yǎng)基。 如果還是不行，考慮那么就剩下?lián)Q換載體或者表達(dá)系統(tǒng)了。在換過不同載體，不同菌株之后仍是表達(dá)不出來的話，筆者的建議是：放棄吧。有些蛋白是用大腸桿菌無法表達(dá)的，或許可以嘗試其它的表達(dá)系統(tǒng)。畢竟，將構(gòu)建好的質(zhì)粒交給細(xì)菌后，有些事情是我們不能控制的，未知 的。嘗試其他的表達(dá)系統(tǒng)未嘗不是一種辦法。不過原核不能表達(dá)，轉(zhuǎn)去做真核，也不保險，這時候試試體外表達(dá)，會更省事，因?yàn)闆]有細(xì)胞生長的限制，更容易得到結(jié)果，可能只是花費(fèi)高些，產(chǎn)量低些。能做出結(jié)果是第一需要時，這些就不能計較太多。 Q1：蛋白表達(dá)出來了，但是跑 SDSPAGE 時大小不符？ 進(jìn)行 SDSPAGE 的時候蛋白的凈電荷會影響遷移率。帶電量高的蛋白會結(jié)合較少的 SDS，因此阻礙了蛋白的泳動。富含脯氨酸的蛋白會在 SDSPAGE 膠中移動得特別慢。如果蛋白的等電點(diǎn)在 5 到 9之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好，那 么目的蛋白遷移率與預(yù)期相差較遠(yuǎn)就很有可能不是由于凝膠電泳造成的。我們前面提到過，在很特殊的情況下稀有密碼子的問題也會造成表達(dá)產(chǎn)物的截短。應(yīng)加以考慮。 這個時候最好利用 C 端或者 N 端的標(biāo)簽進(jìn)行 Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導(dǎo)致多條目的條帶或者比預(yù)期小很多的 25 條帶出現(xiàn)。如果排除以上因素仍是無法找出為何與預(yù)期大小相差很遠(yuǎn)，你只能苦命地重頭再來。如果蛋白酶過高可以換個缺陷菌株試試。 Q2：蛋白不可溶，怎么辦？ 許多外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后都是以包涵體形式存在，包涵體是一種致密、不可 溶的顆粒。一般情況下，形成包涵體表達(dá)產(chǎn)率都很高，并且容易分離，得到比較純的包含體。包涵體致密的結(jié)構(gòu)有助于防止蛋白酶對它的降解作用，如果毒性較強(qiáng)的蛋白形成包涵體也就不會對細(xì)胞產(chǎn)生太大的損傷。如果你表達(dá)蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么出現(xiàn)包涵體也不算太壞，可以用 PBS 將包涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進(jìn)入動物體內(nèi)進(jìn)行免疫。 包含體的形成據(jù)分析原因之一在于表達(dá)量過高，表達(dá)產(chǎn)物來不及折疊為活性形式 ——多數(shù)以高表達(dá)見長的表達(dá)系統(tǒng)都會得到包含體產(chǎn)物。如果融合表達(dá)含有標(biāo)簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性 的情況下進(jìn)行純化，然后復(fù)性。復(fù)性是表達(dá)下游最折磨人的步驟，生物通以后會逐步介紹。但是，在那之前你應(yīng)該還要確定一下，你的蛋白真的是不可溶嗎？細(xì)胞裂解是否完全呢？利用相差顯微鏡或者染色后對細(xì)胞裂解物進(jìn)行觀察。是否仍可以看到完整的細(xì)胞？裂解后的沉淀是否和之前收集細(xì)胞沉淀大小相似？裂解后溶液是否看起來澄清？以上任何一種情況出現(xiàn)都可能意味著細(xì)胞沒有被徹底裂解而導(dǎo)致裂解上清檢測不到產(chǎn)物。如果形成了包涵體，在比較高倍的（ 400）光鏡下可以觀察到大腸桿菌中有致密的結(jié)構(gòu)。因?yàn)榘w可能會占據(jù)細(xì)胞一半體積。 26 Q3：必須要可 溶的蛋白，你可以怎么做？ 如果你希望得到能行使功能的蛋白，那么就最好還是想辦法使蛋白以可溶形式表達(dá)，包涵體復(fù)性也是一條十分曲折的道路。避免包涵體形成的方法很多，比如：選用表達(dá)量不高的表達(dá)系統(tǒng)，選擇有助于可溶性表達(dá)的融合表達(dá)系統(tǒng)比如 pThio， pMal 等等，對于 T7 系統(tǒng)來說降低或者減少誘導(dǎo)條件（例如降低 ITPG 濃度減少 T7 聚合酶）從而降低表達(dá)速度，使用基本培養(yǎng)基等也有助于可溶性表達(dá)。另外一個容易忽視的問題是大腸桿菌內(nèi)還原性過高會導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物不溶，更換菌株例如 Novagen 的 Origami系列也有助于解決這個問題。 一般包涵體可以先使用溫和變性劑（如：低濃度的尿素）和去污劑（如： TritonX 100）將包涵體初步洗滌，之后用 8M 尿素將包涵體溶解?？梢酝ㄟ^透析復(fù)性、或者是在過柱的時候復(fù)性。復(fù)性條件每個蛋白都是不一樣的，所以是一條需要摸索前進(jìn)的道路。有人嘗試當(dāng)?shù)鞍讙煸谥由系臅r候，在還原和氧化的谷胱甘肽存在的情況下用濃度從 6M 到 0M 的鹽酸胍過柱，促使蛋白的折疊。在蛋白重新折疊后用咪唑洗脫。 gus 基因就是轉(zhuǎn) β 葡糖醛酸酶基因 該基因產(chǎn)物為 GUS 蛋白質(zhì)，相當(dāng)穩(wěn)定而不易降解，并為一水解 酵素，有簡易的測定方法；且可使用市售的基質(zhì) (substrate) 在原位 (in situ) 顯現(xiàn)出酵素的活性，以肉眼即可檢測其產(chǎn)物，非常方便。 27 gus 基因存在于 等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼 β 葡萄糖苷酸酶。 β 葡萄糖苷酸酶是一個水解酶，以 β 葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。根據(jù)地 gus 基因檢測所用的底物不同，可以選擇三種檢測方法：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法（靈感度為分光光 度檢測法最高），其中最為常用的是組織化學(xué)法。 組織化學(xué)法檢測以 5溴 4氯 3吲哚 β 葡萄糖苷酸酯（ XGluc）作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞發(fā)生了解 gus 基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出 Gus，在適宜的條件下，該酶就可將 XGluc 水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用于形成的靛藍(lán)染料，它使具 Gus 活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出 Gus 活性。因此利用該方法 可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況 。