【正文】 菌生長繁殖的規(guī)律(1)細(xì)菌的繁殖方式:二分裂方式進(jìn)行無性繁殖(2)細(xì)菌繁殖速度:大多數(shù)細(xì)菌繁殖一代需20～30min,個別細(xì)菌繁殖較慢,如結(jié)核桿繁殖一代需18～20h(3)細(xì)菌群體生長曲線:將細(xì)菌接種于適宜的液體培養(yǎng)中,間隔不同時間取樣測定活菌數(shù),以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)可繪出一條反映細(xì)菌群體生長繁殖規(guī)律的曲線，稱作生長曲線。細(xì)菌群體生長繁殖大致分為4個時期(1）遲緩期:培養(yǎng)最初的1～4h。此期細(xì)菌菌體增大、代謝活躍,但分裂遲緩,菌數(shù)增加不明顯,是細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境的階段(2)對數(shù)期:培養(yǎng)至8～18h。此期細(xì)菌生長迅速、繁殖極快,菌數(shù)呈對數(shù)直線上升,細(xì)菌的形態(tài)、染色性等較典型,對抗生素最敏感,是研究細(xì)胞的最佳時期小(3)穩(wěn)定期:由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、毒性代謝產(chǎn)物的積聚,細(xì)菌繁殖速度減慢,而死亡數(shù)上升,繁殖數(shù)與死亡數(shù)大致平衡:活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定,細(xì)菌可產(chǎn)生外素或抗生素、形成芽胞等。（4)衰亡期:細(xì)菌繁殖速度繼線減慢或停止，死亡數(shù)繼續(xù)上升,死菌數(shù)超過繁殖數(shù),活菌數(shù)下降,細(xì)菌的性狀變異明顯,形態(tài)不易辨認(rèn)、代謝活動停滯,難以鑒定。四、微生物接種微生物的接種的概念:將微生物的純菌種或含有生物的材料(如水土壤等)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上的過程。微生物的接種方法有:涂布法、劃線法、傾注法、點(diǎn)植法、穿刺法、浸洗。涂布接種法:用于紙片藥敏試驗(yàn)和生物制品菌苗的生產(chǎn)。操作方法:將一定量或適量的菌液加入到瓊脂培養(yǎng)基表面,然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布,被接種的菌液均勻分布于瓊脂的表面,然后帖上藥敏紙片,或直接培養(yǎng),本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌均形成菌苔。劃線法(平板劃線分離法):是以混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本或其他培養(yǎng)物,經(jīng)過劃線分離和培養(yǎng)得到單個角落,供細(xì)胞計數(shù)和純培養(yǎng)用。操作方法:(1)右手以持筆式握接種環(huán),在火焰上燒約滅菌。(2)接種環(huán)冷卻后,以無菌操作方法沾取葡萄球菌、大腸桿混合菌1環(huán)。(3)左手持平板培養(yǎng)基,左手拇指、食指開啟平皿蓋,右手將取菌液的接種環(huán)在平板表面的邊緣部分涂抹。燒均接種環(huán),冷卻,自涂抹部分開始,連線在平板表面左右畫線,第一區(qū)畫線約占平板表面的1/4。(4)再次燒均接種環(huán),冷卻,將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)動80176。角左右進(jìn)行第二區(qū)劃線,第二區(qū)劃線與第一區(qū)劃線開始相交2～3條,以后可不相交。燒灼接種環(huán)后用相同方法進(jìn)行第三區(qū)、第四區(qū)、第五區(qū)畫線。(5)接種完畢后,接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌,平板底部做好標(biāo)記(姓名、日期、標(biāo)本名稱等),放37℃溫箱培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。(6)注意事項(xiàng):畫線接種時,力量要適中,接種環(huán)與培養(yǎng)基表面約呈45176。角為宜,切勿劃破培養(yǎng)基表面:畫線要密而不重復(fù),充分利用平板表面；嚴(yán)格無菌操作。傾注平皿法:本法用于飲水、牛乳及尿液標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)的測定。操作方法:將標(biāo)本先用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度,如1:1:100、1:1000,取稀釋好的液體1ml移入無菌培養(yǎng)皿內(nèi),再將已溶化并冷卻到45～50℃的瓊脂15～20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi),混勻,待凝固后置37℃培養(yǎng),可用人工或菌落計數(shù)儀測菌落數(shù),以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。五、微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)是指根據(jù)微生物的生理特征,用適宜的營養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件培養(yǎng)微生物的過程。培養(yǎng)基:人工配制的具有適宜pH值和滲透壓的適合細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基制成后必須經(jīng)過滅菌處理。根據(jù)培養(yǎng)基的物理性狀不同分為液體、固體和半固體三大類,在液體培養(yǎng)基中加入2%～3%%～%瓊脂即可分別制成固體、半固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基主要用于增菌、鑒別和純培養(yǎng),固體平板培養(yǎng)基主要用于分離培養(yǎng),固體斜面培養(yǎng)基主要用于鑒別和純培養(yǎng),而半固體培養(yǎng)基則用于觀察細(xì)菌動力和短期保存菌種。根據(jù)培養(yǎng)基性質(zhì)和用途不同分為五大類：(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含有多數(shù)細(xì)菌生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)成分,如普通瓊脂平板。(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、酵母浸液等營養(yǎng)物質(zhì),供營養(yǎng)要求較高或特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌用,如血平板。(3)選擇培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)或營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制雜菌生長而促進(jìn)目的菌的生長,如用于腸道致病菌分離培養(yǎng)的SS平板。(4)鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入特定的底物和指示劑,測定細(xì)菌對糖、蛋白質(zhì)的分解能力和代謝產(chǎn)物以鑒別細(xì)菌,如糖發(fā)酵管等。(5)厭氧培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基中加入還原劑,并以石蠟或凡士林封口,造成無氧環(huán)境,專供厭氧菌培養(yǎng)用,如皰肉培養(yǎng)基。六、微生物的培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)：適合一般需氧和兼性厭氧菌的培養(yǎng)。需氧培養(yǎng)的常用溫度為35～37℃，適合絕大多數(shù)致病菌生長。培養(yǎng)時間一般18～24小時。厭氧培養(yǎng)：本法適用于專性厭氧菌的培養(yǎng)。表面培養(yǎng)：本法適用于專性需氧菌的培養(yǎng)。深層培養(yǎng)：本法適用于專性厭氧菌的培養(yǎng)。七、農(nóng)業(yè)微生物在生產(chǎn)上的應(yīng)用微生物農(nóng)藥：是利用微生物本身及其代謝產(chǎn)物來預(yù)防病蟲雜草的制劑。分為微生物殺蟲劑、微生物除草劑和農(nóng)業(yè)抗生素。微生物肥料：是以某些有益微生物菌體或產(chǎn)物直接喂養(yǎng)家畜家禽的一中飼料。包括（1）飼用微生物的種類，如細(xì)菌、藻類、酵母菌、霉菌、擔(dān)子菌等；（2）微生物飼料產(chǎn)品種類，如微生物蛋白飼料、微生物發(fā)酵飼料、青貯飼料、飼料微生物添加劑。輔導(dǎo)材料 植物組織培養(yǎng)技術(shù)概述組織培養(yǎng)是應(yīng)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的重要領(lǐng)域,它利用植物細(xì)胞全能性的基本理論,在人工培養(yǎng)的條件下,使離體的植物的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織以及器官長成完整植株的過程。學(xué)習(xí)本章時,除掌握植物組織培養(yǎng)的基本概念和基本理論外,還必須重點(diǎn)掌握組織培養(yǎng)室的主要儀器設(shè)備的功能、使用方法,以及各種培養(yǎng)基的適用對象和制備技術(shù)。對外植體的選擇和滅菌接種過程也必須全面了解。第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)的概念一、概念植物組織培養(yǎng)是指在人工操縱和無菌條件下,將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體,在人工培養(yǎng)基和適宜的培養(yǎng)條件,使其長成完整的植株的過程。由于培養(yǎng)物脫離母株而在試管內(nèi)培養(yǎng),又稱離體培養(yǎng)。具體可分為植物器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。將植物的根、莖、葉、花、果、種子等器官的培養(yǎng)稱植物器官培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)過程中,將營養(yǎng)器官脫分化而形成愈傷組織的培養(yǎng)稱愈傷組織培養(yǎng)。將分化過程中脫離母體體細(xì)施或性細(xì)胞的培養(yǎng)稱細(xì)胞培養(yǎng)。去掉細(xì)胞壁而裸露的原生質(zhì)培養(yǎng)稱原生質(zhì)體培養(yǎng)。將分化過程中成熟或未成熟的離體胚培養(yǎng)稱胚狀體培養(yǎng)。在植物組織培養(yǎng)過程中，由植物體上切取的根、莖、葉、花、果、種子以及被培養(yǎng)的部分組織稱外植體。外植體都是多細(xì)胞的,并且組成它們的細(xì)胞是各種不同的類型。因此,由一個外植體所形成的愈傷組織是異質(zhì)性的,這些細(xì)胞團(tuán)或部分細(xì)胞具有不同的分化器官或其他組織的能力。外植體在人工條件下(無菌條件、人工培養(yǎng)基、適宜溫度、光照)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生脫分化過程,形成愈傷組織。愈傷組織既是細(xì)胞培養(yǎng)的原材料,也是原生質(zhì)體培養(yǎng)的原材料。愈傷組織在特定條件下(無菌條件、人工培養(yǎng)基、適宜溫度、光照)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生再分化過程,形成不定芽、不定根或胚狀體,最后形成完整的小植株。其過程如圖51。脫分化過程是指植物器官的根、莖、葉、花、果、種子在人工條件下失去原有的狀態(tài)和功能,恢復(fù)到能分裂和增殖細(xì)胞的狀態(tài)(愈傷組織)的過程:再分化過程是指將細(xì)胞狀態(tài)(愈傷組織)再次分化產(chǎn)生分生組織,形成器官狀態(tài)(不定根和不定芽)的過程。一個外植體在特定條件下經(jīng)歷了脫分化、再分化過程之后,才能形成完整植株,是因?yàn)檫@些細(xì)胞都具有細(xì)胞的全能性。二、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理(一)植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性,是指植物體上每個具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞,都具有該植物體的全部遺傳信息和產(chǎn)生完整植株的能力。(二)細(xì)胞的分化和形態(tài)建成在通常情況下,性細(xì)胞結(jié)合生長發(fā)育長成合子,最后產(chǎn)生具有完整結(jié)構(gòu)的有機(jī)體。在組織培養(yǎng)中,體細(xì)胞要表現(xiàn)它的全能性,從已經(jīng)有專一功能的細(xì)胞(葉芽能發(fā)育成葉片的功能),在人工培養(yǎng)的特定條件下,經(jīng)過脫分化過程,改變細(xì)胞原來的結(jié)構(gòu)和功能,恢復(fù)到無結(jié)構(gòu)的分生組織狀態(tài)（愈傷組織),從愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)再次分化,進(jìn)行形態(tài)建成而產(chǎn)生不定根、不定芽或胚狀體,形成完整的植株。細(xì)胞脫分化過程的難易程度與植物種類、組織和細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。一般單子葉植物和裸子植物比雙子葉植物難。成年細(xì)胞和組織比幼年細(xì)胞和組織難。單倍體細(xì)胞比二倍體細(xì)胞難。脫分化后的細(xì)胞進(jìn)行再分化過程有兩種不同的形式：一種是器官形態(tài)建成,由愈傷組織不同位分別獨(dú)立形成不定芽和不定根,形成的時間不一致。另一種是胚形態(tài)建成,在愈傷組織表面或內(nèi)部形成很多胚狀體,也稱體細(xì)胞胚狀體。（三）植物的再生功能植物的再生功能是指植物在無性繁殖過程中,利用根莖葉器官而產(chǎn)生不定根成不定芽,形成完整植株的能力。許多植物是靠種子生長、發(fā)育來產(chǎn)生完整植株,而不少的植物種類可通過根、莖、葉等器官再生功能而形成完整的植株。(四)植物再生方式植物再生方式是指植物在組織培養(yǎng)中再分化的類型。植物再生方式可分幾種類型: 切段及叢生芽增殖方式,是指在組培中切段繁殖或產(chǎn)生不定芽增殖的類型。特點(diǎn)是培養(yǎng)過程筒單,技術(shù)容易掌握。成苗快,繁殖效量多。與外植體遺傳性狀相同,不易變異。適應(yīng)多種植物種類,移栽成活率高。 原球莖發(fā)生方式,是指出外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)而產(chǎn)生原球莖增殖快繁的類型。特點(diǎn)是植物器官經(jīng)誘導(dǎo)直接分化原球莖,速度快,繁殖數(shù)量大。遺傳性狀穩(wěn)定,不變異。 不定芽發(fā)生方式,是指植物外植體在組織培養(yǎng)過程中經(jīng)脫分化再分化過程,形成不定芽的類型。由植物器官外植體經(jīng)人工培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)脫分化成愈傷組織,此期間的愈傷組織可大量繁殖,誘導(dǎo)再分化產(chǎn)生不定芽。特點(diǎn)是愈傷組織再分化,產(chǎn)生大量的單芽或叢生芽,增加繁殖數(shù)量。遺傳性狀不穩(wěn)定,易變異。適合于創(chuàng)造有益突變體,培育新品種。 胚狀體發(fā)生方式，是指植物外植體在組織培養(yǎng)過程中經(jīng)脫分化再分化過程,形成胚狀體的類型。植物的葉片、子房、花藥等外植體經(jīng)人工培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)脫分化、再分化產(chǎn)生胚狀體,由胚狀體形成完整小植株。它的發(fā)生和成苗的過程都與合子胚、種子生長發(fā)育類同。特點(diǎn)是形成胚狀體的數(shù)量多,繁殖量大。遺傳性狀不穩(wěn)定,易變異,適合于細(xì)胞工程培育新品種。三、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用（一）優(yōu)良品種的快速繁 （二)莖尖脫毒培育無毒苗（三）組織培養(yǎng)培育新品種 （四）次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)（五）種質(zhì)資源的保存和交換植物組織培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分,細(xì)胞工程、基因工程、酶工程都必須反映植株水平才能利用,組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展有不可估量的前景。四、植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)植物組織培養(yǎng)發(fā)展迅速,應(yīng)用范圍廣泛,具備了以下特點(diǎn): ,繁殖率高 ,利于自動化生產(chǎn)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備與操作技術(shù)一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備植物組織培養(yǎng)整個過程需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室根據(jù)結(jié)構(gòu)和應(yīng)用范圍分為組培準(zhǔn)備室、無菌操作室、試管苗培養(yǎng)室。(一)組織培養(yǎng)準(zhǔn)備室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備室工作內(nèi)容較多,處理事務(wù)數(shù)量大,可分為化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、洗刷室、滅菌室。 化學(xué)實(shí)驗(yàn)空主要用于化學(xué)藥品的稱量和溶液的配制?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)室是配制大量元素和微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、培養(yǎng)基溶液的場所,需要安靜、清潔無灰塵,確保溶液的準(zhǔn)確性和安全性。 洗刷室主要用于培養(yǎng)容器的洗刷工作。 滅菌室主要用于培養(yǎng)基的消毒滅菌工作。（二）無菌操作室無菌操作室,也叫無菌接種室。主要用于植物材料的消毒接種、試管苗的繼代轉(zhuǎn)苗在無菌環(huán)境中進(jìn)行操作。無菌操作室配置超凈工作臺,用于無菌接種和試管苗轉(zhuǎn)接。（三）試管苗培養(yǎng)室試管苗培養(yǎng)室主要用于植物材料接種后培養(yǎng)、試管苗繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)。工廠化組培生產(chǎn)設(shè)計培養(yǎng)室考慮節(jié)電、降低成本問題。北方培養(yǎng)室選用雙層窗結(jié)構(gòu)保溫。南方培養(yǎng)室選用四面大窗戶,充分利用自然光。二、常用的儀器和設(shè)備（一）天平主要用于試劑的稱量。 ,用于稱取蔗糖或瓊脂等。 ,用于稱取培養(yǎng)基中的大量元素。 ,用于稱量培養(yǎng)基中的有機(jī)物和部分微量元類。 ,用于稱量培養(yǎng)基中的微量元素、植物激素類等。分析天平和電光分析天平放置的位置要平穩(wěn)、干燥,避免腐蝕性藥品,用完后要罩蓋。(二)冰箱主要用于各種有機(jī)物、植物激素試劑及培養(yǎng)基母液的低溫貯藏,細(xì)胞組織和試驗(yàn)材料的保存,溫度保持46℃為宜。(三)干燥箱要用于玻器皿、小型金屬接種工具的干燥滅菌。洗凈后的玻璃器皿,如迅速干燥,可放入干燥箱內(nèi)烘干,溫度以80℃為宜。接種用的鑷子、接種針、彎頭剪、解剖刀等適合干熱滅菌,溫度為120～160℃,持續(xù)1～3小時即可。(四)蒸餾水器 (五)振蕩器和旋轉(zhuǎn)搖床 (六)空調(diào)機(jī)無菌操作室和試管苗培養(yǎng)室要求恒溫條件,需配置空調(diào)機(jī)調(diào)節(jié)溫度,在過高過低的溫度下不利于操作和試管苗的生長發(fā)育。(七)酸度計培養(yǎng)基中的pH十分重要。配培養(yǎng)基時需酸度計測定pH。酸度計的測定精密度比試紙高，一般用以科研。試管苗工廠化生產(chǎn)常用pH試紙,成本低。(八)雙目實(shí)體顯微鏡用于解剖觀察植物各器官和組織,進(jìn)行培養(yǎng)物(如胚、莖尖、根尖等)的分離,也可以從培養(yǎng)玻璃器皿外部觀察細(xì)胞或組織的生長情況。(九)高壓蒸汽滅菌鍋主要用于培養(yǎng)基消毒滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋有小型手提式、大型臥式、大型立式等多種。研究工作適合于小型滅菌鍋,靈活方便。工廠化生產(chǎn)適合于大型的滅菌鍋,周轉(zhuǎn)快成本低。高壓蒸汽滅菌鍋一般是電加溫,清潔、安全、效率高。(十)超凈工作臺主要用于無菌操作室內(nèi)接種和試管苗繼代轉(zhuǎn)接無菌操作裝置。超凈工作臺有單人操作、雙人操作、水平風(fēng)、垂直風(fēng)等多種規(guī)格,操作無菌效果好、使用方使、便于操作。超凈工作臺是通過風(fēng)機(jī)交流,將空氣經(jīng)微生物過濾器過濾而到達(dá)無菌臺面,使用時間長會引起堵塞,影響過濾效果。一般使用6個月左右需更換過濾器,確保超凈無菌的效果。三、培養(yǎng)器皿及用具(一)玻璃器皿長時間進(jìn)行培養(yǎng)和貯藏藥液用的玻璃器皿,要求對堿性溶解度小的優(yōu)質(zhì)硬質(zhì)玻璃制成,而且能耐高壓滅菌。主要用于莖尖