培訓(xùn)講義-修改后-資料下載頁
2025-04-16 22:38本頁面
【正文】 ddH2O 8ul10x buffer 2uL限制性內(nèi)切酶 1uLDNA 1uLddH2O 16ul2. 37℃（或其他酶的最適溫度）孵育14小時。3. 電泳檢測酶切結(jié)果。實(shí)驗(yàn)三 植物組織培養(yǎng)相關(guān)操作【相關(guān)名詞】外植體：在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)對象的起始材料。培養(yǎng)基：在組織培養(yǎng)中用于給植物提供營養(yǎng)、固定植株的材料和試劑。無菌操作：在整個操作的進(jìn)行過程中，材料所處的環(huán)境、所使用的試劑、器皿、器具都是無菌的，這樣的操作過程稱為無菌操作。接種：把培養(yǎng)材料放到培養(yǎng)基中或插到培養(yǎng)基上的操作。繼代培養(yǎng)：把培養(yǎng)材料接種到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。表面消毒：用消毒液把植物材料表面的微生物殺死，防止組織培養(yǎng)中污染的過程?！局参锊牧稀?紫花苜蓿無菌苗。 煙草無菌苗。 溫室栽培的紫薯?！緝x器、器具、器皿及其他】 儀器：電子秤、pH計、磁力攪拌器（帶攪拌子）、高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌器、超凈工作臺。 器具：移液器（吸頭）、鑷子、手術(shù)剪、手術(shù)刀（刀柄、刀片）。 器皿：量筒、塑料培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)瓶、三角燒瓶、玻璃培養(yǎng)皿、稱量皿。 其他：封口膜、酒精棉、濾紙等?！驹噭┡渲啤?培養(yǎng)基MSO培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基粉末和30g 蔗糖，加入裝有900ml 蒸餾水的1L三角燒瓶中，加入攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌。待其溶解后，定容到1L，并用1N NaOH和1N 。調(diào)好pH值后，加入8g 瓊脂粉，用封口膜封號瓶口，等待滅菌。MB培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基粉末和30g 蔗糖，加入裝有900ml 蒸餾水的1L三角燒瓶中，加入攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌。待其溶解后，加入1ml B5有機(jī)母液、NAA、6BA并定容到1L，并用1N NaOH和1N 。調(diào)好pH值后，加入8g 瓊脂粉，用封口膜封號瓶口，等待滅菌。 消毒液70%酒精：用量筒量取700ml 95%醫(yī)用酒精，加入200ml 蒸餾水，混合均勻即成。% HgCl2：稱取1g HgCl2，在三角燒瓶內(nèi)溶于1L 蒸餾水中，用封口膜封號瓶口，等待滅菌。無菌水：裝1L蒸餾水于三角燒瓶中，用封口膜封號瓶口，等待滅菌?！静僮鞑襟E】（一） 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 培養(yǎng)基滅菌 把高壓蒸汽滅菌鍋電源接通，確認(rèn)鍋內(nèi)的水處于高水位；把培養(yǎng)基以及所有需要滅菌的試劑放入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，設(shè)定滅菌時間（20min）、溫度（121℃），打開氣閥，開始滅菌。待鍋內(nèi)溫度升到102℃以上，將氣閥關(guān)閉，繼續(xù)滅菌。滅菌時間到后，小心打開氣閥，緩慢放氣。待鍋內(nèi)熱氣排盡后，打開鍋蓋，把物品移到超凈工作臺中。 超凈工作臺消毒把超凈工作臺內(nèi)的干熱滅菌器電源打開（如果不用，則不用打開），把培養(yǎng)瓶/皿（或培養(yǎng)基）放入超凈臺內(nèi)，打開超凈臺紫外燈，消毒20~30min。之后關(guān)掉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)和照明燈備用。注意：以下的操作（除紫薯藤條的沖洗外）均為無菌操作，在超凈工作臺內(nèi)操作前，應(yīng)先用酒精棉把手擦凈，進(jìn)行表面消毒后方可進(jìn)行。 培養(yǎng)基分裝待培養(yǎng)基冷卻到50~60℃左右，把培養(yǎng)基均勻地分裝到培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，并在瓶、皿上做好標(biāo)記。每升培養(yǎng)基可以倒20瓶/皿。（二） 紫花苜蓿的繼代培養(yǎng)把干熱滅菌器中的手術(shù)剪和鑷子取出，晾涼備用；用少量無菌水玻璃培養(yǎng)皿的濾紙濕潤備用。把裝有紫花苜蓿無菌苗的培養(yǎng)瓶的外部用酒精棉擦凈，打開蓋子，用剪刀把紫花苜蓿齊根部剪斷，用鑷子取出，放到潤濕的濾紙上。用剪刀剪去葉子，并把去掉葉子后的莖剪成段，每段留一個腋芽；用鑷子把莖段接到塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)的MSO培養(yǎng)基上（生理下端插入培養(yǎng)基內(nèi)），蓋上瓶蓋。每瓶接種4~6段。新接種的瓶子做好標(biāo)記，放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。（三） 煙草葉片的再生誘導(dǎo)把干熱滅菌器中的手術(shù)剪、鑷子和手術(shù)刀取出，晾涼備用；用少量無菌水玻璃培養(yǎng)皿的濾紙濕潤備用。把裝有煙草無菌苗的培養(yǎng)瓶的外部用酒精棉擦凈，打開蓋子，選長勢好、比較嫩的葉片用剪刀從葉柄剪下，用鑷子取出背面朝上放在潤濕的濾紙上。用鑷子固定住葉片，用手術(shù)刀小心把主葉脈去除。去除主葉脈的葉片，用手術(shù)刀切成3mm╳3mm的小片，背面朝下，放在培養(yǎng)皿內(nèi)的MB培養(yǎng)基上，用封口膜封住培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記。放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。（四） 紫薯藤條的表面消毒和接種、培養(yǎng)把干熱滅菌器中的手術(shù)剪和鑷子取出，晾涼備用；用少量無菌水玻璃培養(yǎng)皿的濾紙濕潤備用。1. 紫薯藤條的表面消毒：將溫室中剪下的紫薯藤條用自來水洗凈，并用吸水紙吸干（超凈工作臺外操作）。洗凈的紫薯藤條剪成每段約3~5個腋芽的莖段，棄去葉子，放入燒杯中，倒入70%酒精直至藤條被完全浸沒，消毒30sec，期間用鑷子把藤條稍作晃動。倒掉酒精，% HgCl2溶液至浸沒，消毒8min，期間鑷子把藤條晃動數(shù)次。倒掉HgCl2溶液，加入無菌水，劇烈晃動，漂洗3分鐘。重復(fù)漂洗三次。2. 紫薯藤條的接種、培養(yǎng)：漂洗好的藤條放到事先準(zhǔn)備好的用無菌水潤濕的濾紙上，用剪刀剪去藤條兩端受傷害的部分，把中間部分剪成數(shù)段，每段一個腋芽。用鑷子把莖段接到塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)的MSO培養(yǎng)基上（生理下端插入培養(yǎng)基內(nèi)），蓋上瓶蓋。每瓶接種4~6段。新接種的瓶子做好標(biāo)記，放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。18 / 1
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