【正文】 ”引物進行反應，會有大量產(chǎn)物被擴增出來。如果沒有多個5’或者3’引物箭頭也提示這一對引物沒有錯配點。l 單擊上面窗口里引物對，觀察下面窗口里的產(chǎn)品棒變得越來越細表示預期的擴增物也越來越少。注意有8個引物對有錯誤的配對點，用粉紅色或淡綠色箭頭指示出來。第13對和第22對正向引物有錯配點（右邊顯示），就會用第二條產(chǎn)品棒的表示錯誤的產(chǎn)品大小。查看引物的其他信息PrimerSelect能預測引物形成selfdimers, pairdimers and hairpins的可能性。l 單擊選定“Best choice”引物。l 從報告菜單（REPORT MENU），選Amplification Summary，打開左面的窗口。顯示用所選個引物做PCR擴增反應的報告。l 選擇Composition Summary，打開左面的窗口，描述擴增區(qū)和引物對的堿基組成。l 從報告菜單，選擇Self Dimers，Pair Dimers和／或Hairpins打開新窗口顯示每種二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果。SelfDimer形成窗口如右。按照引物特點分類PrimerSelect在自動將引物按照從好到壞的順序分類以前，已經(jīng)計算了引物的各個特點。Located Primers amp。 Probes窗口是我們能夠根據(jù)引物的不同特點，如引物位置、長度、溶解點或自由能等，來對引物進行分類。這里讓我們用溶解點來分類引物。l 從報告菜單，選擇Located Primers amp。 Probes打開左面的窗口。窗口顯示符合我們標準的引物的一覽表。在沒有特別指定的情況下，引物按照位置排列。l 從LOCATE MENU選擇Sort Primers打開下邊對話框。l 保留對正向和反向引物的選定，去除對By Position的選定。選定By Tm Nearest方框，輸入65。l 單擊同意，現(xiàn)在兩個窗口里的引物按照融解溫度離65oC最近的程度依次排列。改變引物長度PrimerSelect’s工作臺允許你在引物中引入限制性酶切位點，突變，改變使用的密碼子，核查引物二級結(jié)構(gòu)，查找錯配點。在這一節(jié)中，我們將用正向引物工作臺來擴展我們的引物長度。l 雙擊選定正向“Best choice”引物。l 從編輯菜單，選擇Work on Upper Primer打開下面的窗口。l 確認Dimer，Hairpin和Priming Sites調(diào)色板工具（窗口左側(cè)從頂端起的46）已經(jīng)激活。讓我們仔細查看一下工作臺。在窗口下邊的第3排可以看見引物序列。序列兩端的三角形“handles”允許你縮短或者延長序列。在窗口的左上角的標題告訴我們引物的長度是23核苷酸，；而底部窗口的綠色棒顯示引物在序列上的大概位置。下面的信息告訴我們沒有大于2 bp的二聚體形成，并且引物只能形成一個并不理想的發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)。拖動窗口左邊的滾動條之間的黑框調(diào)整上下窗口的比例。l 拖動引物左上黑三角形直到長度延伸到33核苷酸?，F(xiàn)在引物的長度已經(jīng)顯示在窗口的標題中。，將難以進行PCR?？聪旅娴拇翱谟卸垠w和發(fā)卡形成，并標記（壞?。?。由于長引物容易形成穩(wěn)定的二聚體和發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，所以我們設計的引物經(jīng)常較短。l 再一次拖三角直到引物最初的23核苷酸。窗口又和我們開始打開它的時候一樣了。引物中引入突變PrimerSelect工作臺可以很容易的在引物中引入突變。我們“Best choice”的正向引物序列只編碼一個苯丙氨酸。在這一節(jié)中，我們把讀框1的苯丙氨酸通過改變讀框中的密碼子轉(zhuǎn)換成蘇氨酸。轉(zhuǎn)換完成后我們將可以觀察到我們變化的效果。l 點擊引物下面，讀框1中綠色的苯丙氨酸，會出現(xiàn)一個小盒子（如右）。盒子中顯示全部4種可能的苯丙氨酸密碼子和詞“Other.”標記的GCC是這個苯丙氨酸殘基的密碼子。l 選擇Other會自動跳出一個子菜單，其中顯示所有的氨基酸及其代號，在“TThreonine.”上點擊一下，模板序列上的堿基組成沒有改變，但是引物序列和其編碼的氨基酸（ThrAla）發(fā)生了改變。Thr顯示為紅色，表明它是從最初的引物序列上突變得到的。查看屏幕底部的左角，可以看到引物形成了一個穩(wěn)定的二聚體。我們可以通過給我們的Thr殘基做沉寂突變來刪除這個不受歡迎的二聚體。我們試著把蘇氨酸的密碼子改變?yōu)锳CC。這個密碼子與苯丙氨酸密碼子（GCC）只有一個核苷酸不同。l 單擊紅的Thr殘基，從菜單中選ACC代替現(xiàn)在的ACT。下面的窗口顯示從G到A的單一的核苷酸變化去除了二聚體。另外。也許正向引物新的溶解溫度可以與反向引物匹配，但是我們可以找到與之更相匹配的反向引物。l 在工作臺的右上的白色文框輸入突變引物的名字。l 點擊窗口左側(cè)頂端的OK鈕，保存突變的引物。l 從LOCATE MENU中選擇PCR Primer Pairs更新窗口。新的引物對會加入窗口中，突變的正向引物用淡綠色的箭頭表示。l 打開建議簾。沒有警告的第一個突變引物對是從頂端起的第11個。這一引物對被評定為“OK”，如果我們必須使用突變引物的話，雖然用它擴增的產(chǎn)品數(shù)量不多，但是它卻是我們最好的選擇。設計新引物當你初次打開PrimerSelect的時候，引物目錄是空的。如果你愿意，你可以用這個目錄來儲備任何在PrimerSelect中設計或者被修改的引物。LOCATE MENU中的Only Cataloged Primers指令可以讓你在已經(jīng)儲存地引物中選擇合適的引物供使用。在這一節(jié)中，我們學習如何設計引物并將他們輸入目錄表的方法。l 從LOG MENU選擇Primer Catalog打開引物目錄表。注意到我們突變的正向引物已經(jīng)在目錄表中。引物左面的檢測標志表明引物處于激活狀態(tài)，Ｖ形臂章（）（視窗）或子彈（蘋果計算機）顯示它已經(jīng)通過了最初二級結(jié)構(gòu)檢測。l 按回車鍵創(chuàng)建一個新的引物區(qū)。輸入“Test Primer”。l 按Tab鍵。l 輸入“GIANTCATSNABMANYWARYRATS”。l 按Tab鍵。l 輸入“Contains 46% ambiguous bases”。l 按回車鍵結(jié)束。引物目錄表應該如右圖。如果我們的引物已經(jīng)通過了最初二級結(jié)構(gòu)檢測，則引物左側(cè)出現(xiàn)Ｖ形臂章或槍彈?，F(xiàn)在沒有Ｖ形臂章或槍彈，說明我們引物測試失敗。讓我們核查為什么：l 從報告菜單，選Primer Self Dimer，可以看出該引物可以形成12對穩(wěn)定的二聚體。l 從報告菜單，選Primer Hairpins，可以看出該引物也可以形成5個穩(wěn)定的發(fā)卡。如同我們預測的那樣，我們序列里的模糊堿基的百分比過高會使得它那以用來進行PCR反應。使用寡核苷酸訂購表PrimerSelect提供兩種寡核苷酸訂購表：Generic 和 IDT (Integrated Data Technologies, Inc.)。l 點擊選定正向“Best choice”引物。l 從LOG MENU選擇Oligo Request Form中的IDT打開IDT寡核苷酸訂購表（如右）。我們反向和正向引物序列自動輸入表格。如果我們想定購引物，我們只需填表打印，然后傳真或用電子信件郵給頁底部的地址即可。l 從文件菜單，在返回附近到坐落的引物一對窗口口做選擇。PrimerSelect文件保存l 從文件菜單，選保存。l 選定文件的保存位置，命名。l 單擊保存（蘋果計算機）或同意（視窗）。任何對引物，或者引物目錄表的操作都將和文件一起被保存。 Protean的使用方法Protean可以使用多種方法分析、預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并以圖形化的方式展示出來。預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。各類方法按照科學概念進行分類。幾個方法可以同時存在于一個概念群中，如用于分析疏水性概念的方法就有好幾種，不過有的概念只有一種方法可供選擇，如柔韌性。你可以按照任何順序在Protean文件上展示各種方法計算的結(jié)果。另外，Protean可以輸入來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中標注序列特點，而且允許你注釋新特點。和其他Lasergene應用程序一樣，Protean也提供整合的BLAST查找功能。創(chuàng)建蛋白質(zhì)分析文件這一節(jié)，我們將為人的鈣調(diào)蛋白序列創(chuàng)建一個新Protean分析文件。l 從文件菜單選擇New打開右面的對話框，然后打開名為“Demo Sequences.”的文件夾。l 雙擊“Human Calmodulin” (或 “Human ”)，這樣就打開下面的分析文件窗口：Protean’s蛋白質(zhì)分析方法打開序列后就是選擇應用方法。方法結(jié)果的圖形顯示可以幫助你選擇感興趣序列的特點。對于我們打開的序列，你會發(fā)現(xiàn)只有下面方法中的幾個被展示出來了，下列方法都可以使用：l Title——給文件取名。l Ruler——給文件加標尺。l Sequence——顯示序列。l Protease Map——識別序列上的蛋白酶酶切位點，并且顯示酶切圖譜。l PatternsProsite數(shù)據(jù)庫——在Prosite數(shù)據(jù)庫中檢索你的序列。l PatternsAriadne文件——在序列上尋找用戶指定的Patterns。l 電荷密度——電荷——預測電荷在特定的序列范圍上的分布。l 二級結(jié)構(gòu)——Coiled Coil——預測跨膜區(qū)的阿爾法螺旋。l 二級結(jié)構(gòu)——GarnierRobson——計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性。l 二級結(jié)構(gòu)——DeleageRoux——蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型預測。l 二級結(jié)構(gòu)——ChouFasman——通過序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。l Hydropathy－GoldmanEnglemanSteitz－預測可以跨過細胞膜的非極性阿爾法螺旋。l Hydropathy－KyteDoolittle——根據(jù)序列的氨基酸組成預測蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)。l Hydropathy－HoppWoods－通過計算蛋白質(zhì)序列上的最大局部親水性尋找蛋白質(zhì)的抗原決定簇。l Antigenicity－Sette MHC Motifs——預測短肽上與老鼠MHC II d型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點。l Antigenicity－AMPHI－根據(jù)序列預測免疫優(yōu)勢輔助性T淋巴細胞抗原位點。l Antigenicity－RothbardTaylor－預測含有特定基序（motif）的潛在T淋巴細胞抗原決定簇。l Antigenicity－JamesonWolf－通過聯(lián)合現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測方法預測潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇。l Amphiphilicity－Eisenberg－預測Eisenberg Moment。l 表面可能性——Emini——預測特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)的表面的可能性。l 柔韌性－KarplusSchulz－預測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性。分析方法應用應用新Protean方法的步驟是：把所用方法從More Methods菜單移入方法簾，然后拖入分析窗口，基本上與前面介紹的GeneQuest方法相同。在這一節(jié)中，我們將練習使用Deleage amp。 Roux分析方法預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。l 從分析菜單（ANALYSIS MENU）選擇Show Available，或拖動分析窗口左上的小環(huán)打開方法簾。方法簾中包括了全部已用于分析你的序列的方法。l 你會發(fā)現(xiàn)Deleage amp。 Roux方法并不在其中。從方法簾的頂端，點擊More Methods打開下面的子菜單，里面有所有可以使用的方法。從Secondary Structure的子菜單中單擊Deleage amp。 Roux，這樣Deleage amp。 Roux就進入方法簾。l 單擊方法左邊的三角形打開方法如右，如果有數(shù)字挨著圖標，說明該方法已經(jīng)被用于分析，否則沒有被用于序列分析，數(shù)字的多少代表方法正在被使用的次數(shù)。由于我們還沒有把Deleage amp。 Roux用于序列分析，所以其左側(cè)沒有數(shù)字。l 點擊方法左邊的空白區(qū)域去除對方法的選擇。然后單擊“Alpha, Regions,”，并將它拖入分析窗口。預測的蛋白質(zhì)阿爾法螺旋區(qū)域即展示在分析窗口中。改變方法參數(shù)下面我們改變Deleage amp。 Roux方法的參數(shù)，然后看一看參數(shù)改變前后這個方法預測的結(jié)果有什末不同。l 重復上述操作將另一個Deleage amp。 Roux方法應用于分析窗口，并將兩個Deleage amp。 Roux放在一起?？梢钥闯霈F(xiàn)在有兩個完全相同的預測結(jié)果。l 雙擊其中一個會打開一個參數(shù)對話框，選擇A + B，單擊同意。此時在分析窗口上，相應的區(qū)域由于計算參數(shù)的改變立即發(fā)生相應變化?，F(xiàn)在你可以比較兩個參數(shù)計算結(jié)果的差別。（注：此時，如果你把最初的方法再用于分析窗口，則改變的參數(shù)自動應用于新加入的方法。）優(yōu)化結(jié)果顯示（與GeneQuest相似，這里省略）使用蛋白酶消化與SDS PAGE電泳Protean可以識別蛋白序列上的蛋白酶酶切位點，并將酶切片段的電泳結(jié)果以圖形展示出來。l 從More Methods菜單中將ProteaseProtease Map方法移動到方法簾。l 單擊挨著方法名字的藍色三角形查看蛋白酶一覽表。點擊方法左邊的空白區(qū)域去除對蛋白酶的選擇。l 選擇“Chymotrypsin”和“CNBr.”，將它們拖入分析窗口。兩種蛋白酶的識別位點顯示如右?，F(xiàn)在至少一種蛋白酶被應用，我們可以模擬凝膠分離。l 單擊調(diào)色板工具中的范圍選擇器（Range Selector）（箭圖標）去除對應用的蛋白酶方法的選擇。l 從SITES amp。 FEATURES 菜單，選擇SDS PAGE Gel Simulation。酶切片段的分離結(jié)果會自動顯示出來（如右）。在每個上面凝膠柱對應蛋白酶的名字和分子量。l 當光標在凝膠上面移動時，你可以隨時查看到相應位置的蛋白質(zhì)分子量。移動光標到任何片段上。窗口最上邊的標題顯示片段的范圍，大小，分子量，等電點和HPLC滯留時間。l 為了繼續(xù)一節(jié)，關上SDS PAGE Gel Simulation窗口。Features注釋（與G