【正文】 Features注釋（與Ge。窗口最上邊的標(biāo)題顯示片段的范圍，大小，分子量，等電點(diǎn)和HPLC滯留時間。l 當(dāng)光標(biāo)在凝膠上面移動時，你可以隨時查看到相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)分子量。酶切片段的分離結(jié)果會自動顯示出來（如右）。l 從SITES amp?，F(xiàn)在至少一種蛋白酶被應(yīng)用，我們可以模擬凝膠分離。l 選擇“Chymotrypsin”和“CNBr.”，將它們拖入分析窗口。l 單擊挨著方法名字的藍(lán)色三角形查看蛋白酶一覽表。）優(yōu)化結(jié)果顯示（與GeneQuest相似，這里省略）使用蛋白酶消化與SDS PAGE電泳Protean可以識別蛋白序列上的蛋白酶酶切位點(diǎn)，并將酶切片段的電泳結(jié)果以圖形展示出來?，F(xiàn)在你可以比較兩個參數(shù)計算結(jié)果的差別。l 雙擊其中一個會打開一個參數(shù)對話框，選擇A + B，單擊同意。 Roux放在一起。l 重復(fù)上述操作將另一個Deleage amp。改變方法參數(shù)下面我們改變Deleage amp。然后單擊“Alpha, Regions,”，并將它拖入分析窗口。 Roux用于序列分析，所以其左側(cè)沒有數(shù)字。l 單擊方法左邊的三角形打開方法如右，如果有數(shù)字挨著圖標(biāo)，說明該方法已經(jīng)被用于分析，否則沒有被用于序列分析，數(shù)字的多少代表方法正在被使用的次數(shù)。 Roux，這樣Deleage amp。從方法簾的頂端，點(diǎn)擊More Methods打開下面的子菜單，里面有所有可以使用的方法。l 你會發(fā)現(xiàn)Deleage amp。l 從分析菜單（ANALYSIS MENU）選擇Show Available，或拖動分析窗口左上的小環(huán)打開方法簾。在這一節(jié)中，我們將練習(xí)使用Deleage amp。l 柔韌性－KarplusSchulz－預(yù)測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性。l Amphiphilicity－Eisenberg－預(yù)測Eisenberg Moment。l Antigenicity－RothbardTaylor－預(yù)測含有特定基序（motif）的潛在T淋巴細(xì)胞抗原決定簇。l Antigenicity－Sette MHC Motifs——預(yù)測短肽上與老鼠MHC II d型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點(diǎn)。l Hydropathy－KyteDoolittle——根據(jù)序列的氨基酸組成預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水區(qū)和親水區(qū)。l 二級結(jié)構(gòu)——ChouFasman——通過序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。l 二級結(jié)構(gòu)——GarnierRobson——計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性。l 電荷密度——電荷——預(yù)測電荷在特定的序列范圍上的分布。l PatternsProsite數(shù)據(jù)庫——在Prosite數(shù)據(jù)庫中檢索你的序列。l Sequence——顯示序列。對于我們打開的序列，你會發(fā)現(xiàn)只有下面方法中的幾個被展示出來了，下列方法都可以使用：l Title——給文件取名。l 雙擊“Human Calmodulin” (或 “Human ”)，這樣就打開下面的分析文件窗口：Protean’s蛋白質(zhì)分析方法打開序列后就是選擇應(yīng)用方法。創(chuàng)建蛋白質(zhì)分析文件這一節(jié)，我們將為人的鈣調(diào)蛋白序列創(chuàng)建一個新Protean分析文件。另外，Protean可以輸入來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注序列特點(diǎn)，而且允許你注釋新特點(diǎn)。幾個方法可以同時存在于一個概念群中，如用于分析疏水性概念的方法就有好幾種，不過有的概念只有一種方法可供選擇，如柔韌性。預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。任何對引物，或者引物目錄表的操作都將和文件一起被保存。l 選定文件的保存位置，命名。l 從文件菜單，在返回附近到坐落的引物一對窗口口做選擇。我們反向和正向引物序列自動輸入表格。l 點(diǎn)擊選定正向“Best choice”引物。如同我們預(yù)測的那樣，我們序列里的模糊堿基的百分比過高會使得它那以用來進(jìn)行PCR反應(yīng)。讓我們核查為什么：l 從報告菜單，選Primer Self Dimer，可以看出該引物可以形成12對穩(wěn)定的二聚體。如果我們的引物已經(jīng)通過了最初二級結(jié)構(gòu)檢測，則引物左側(cè)出現(xiàn)Ｖ形臂章或槍彈。l 按回車鍵結(jié)束。l 按Tab鍵。l 按Tab鍵。l 按回車鍵創(chuàng)建一個新的引物區(qū)。注意到我們突變的正向引物已經(jīng)在目錄表中。在這一節(jié)中，我們學(xué)習(xí)如何設(shè)計引物并將他們輸入目錄表的方法。如果你愿意，你可以用這個目錄來儲備任何在PrimerSelect中設(shè)計或者被修改的引物。這一引物對被評定為“OK”，如果我們必須使用突變引物的話，雖然用它擴(kuò)增的產(chǎn)品數(shù)量不多，但是它卻是我們最好的選擇。l 打開建議簾。l 從LOCATE MENU中選擇PCR Primer Pairs更新窗口。l 在工作臺的右上的白色文框輸入突變引物的名字。另外。l 單擊紅的Thr殘基，從菜單中選ACC代替現(xiàn)在的ACT。我們試著把蘇氨酸的密碼子改變?yōu)锳CC。查看屏幕底部的左角，可以看到引物形成了一個穩(wěn)定的二聚體。l 選擇Other會自動跳出一個子菜單，其中顯示所有的氨基酸及其代號，在“TThreonine.”上點(diǎn)擊一下，模板序列上的堿基組成沒有改變，但是引物序列和其編碼的氨基酸（ThrAla）發(fā)生了改變。l 點(diǎn)擊引物下面，讀框1中綠色的苯丙氨酸，會出現(xiàn)一個小盒子（如右）。在這一節(jié)中，我們把讀框1的苯丙氨酸通過改變讀框中的密碼子轉(zhuǎn)換成蘇氨酸。引物中引入突變PrimerSelect工作臺可以很容易的在引物中引入突變。l 再一次拖三角直到引物最初的23核苷酸。看下面的窗口有二聚體和發(fā)卡形成，并標(biāo)記（壞?。，F(xiàn)在引物的長度已經(jīng)顯示在窗口的標(biāo)題中。拖動窗口左邊的滾動條之間的黑框調(diào)整上下窗口的比例。在窗口的左上角的標(biāo)題告訴我們引物的長度是23核苷酸，；而底部窗口的綠色棒顯示引物在序列上的大概位置。在窗口下邊的第3排可以看見引物序列。l 確認(rèn)Dimer，Hairpin和Priming Sites調(diào)色板工具（窗口左側(cè)從頂端起的46）已經(jīng)激活。l 雙擊選定正向“Best choice”引物。改變引物長度PrimerSelect’s工作臺允許你在引物中引入限制性酶切位點(diǎn)，突變，改變使用的密碼子，核查引物二級結(jié)構(gòu)，查找錯配點(diǎn)。選定By Tm Nearest方框，輸入65。l 從LOCATE MENU選擇Sort Primers打開下邊對話框。窗口顯示符合我們標(biāo)準(zhǔn)的引物的一覽表。l 從報告菜單，選擇Located Primers amp。 Probes窗口是我們能夠根據(jù)引物的不同特點(diǎn)，如引物位置、長度、溶解點(diǎn)或自由能等，來對引物進(jìn)行分類。按照引物特點(diǎn)分類PrimerSelect在自動將引物按照從好到壞的順序分類以前，已經(jīng)計算了引物的各個特點(diǎn)。l 從報告菜單，選擇Self Dimers，Pair Dimers和／或Hairpins打開新窗口顯示每種二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果。顯示用所選個引物做PCR擴(kuò)增反應(yīng)的報告。l 單擊選定“Best choice”引物。第13對和第22對正向引物有錯配點(diǎn)（右邊顯示），就會用第二條產(chǎn)品棒的表示錯誤的產(chǎn)品大小。l 單擊上面窗口里引物對，觀察下面窗口里的產(chǎn)品棒變得越來越細(xì)表示預(yù)期的擴(kuò)增物也越來越少。左面的那個單一的粗黑棒提示用我們“Best choice”引物進(jìn)行反應(yīng)，會有大量產(chǎn)物被擴(kuò)增出來。這些替代的引物對擴(kuò)增的區(qū)域和上面選定的引物一樣，所不同的是他們的序列有些不一樣。注意現(xiàn)在的“Best choice.”是PrimerSelect根據(jù)在最初的條件中設(shè)定的參數(shù)計算得到的。因?yàn)檎{(diào)色板工具中的Alternate Pairs被默認(rèn)激活 （在窗口左面工具中），所以底部窗口顯示的是上面窗口選定的引物對的替代引物對一覽表。l 從LOCATE MENU選擇PCR Primer Pairs。成對的綠色和紅色的三角形分別標(biāo)記所設(shè)定的正向和反向引物的范圍。在Lower Primer Locations右面的方框中輸入2250和2500。當(dāng)在全序列中設(shè)計編碼區(qū)的PCR引物時，這是最好的選擇。這個對話框允許我們根據(jù)給的序列的長度來限制引物的位置。l 不改變默認(rèn)設(shè)定和單擊Cancel退出。這對話框可以用來設(shè)定各種參數(shù)諸如：引物長度、最大的3’pentamer穩(wěn)定性和可接受的重疊。定義引物特點(diǎn)和位置下面我們開始確定引物的類型。l 從“Demo Sequences”（視窗口）的文件，或者PBR322（蘋果計算機(jī)），單擊Add添加序列到右面的窗口。l 從文件菜單，選擇輸入序列（Enter Sequence）。首先我們從打開模板序列開始。創(chuàng)建PrimerSelect文件我們將以克隆載體pBR322為模板DNA序列。如果你選擇并優(yōu)化了你的引物，PrimerSelect可以讓你建立有關(guān)模板，引物，擴(kuò)增的文件。在模板處理后，PrimerSelect按照用戶定義的參數(shù)確定引物的位置，并給引物評分，然后篩選出模板序列上的最佳引物序列。輸入你的DNA，RNA或反向翻譯的蛋白質(zhì)模板序列后，PrimerSelect就可以在pentamer窗口計算序列的融解溫度，自由能和末端自由能。l 對隊(duì)列和隊(duì)列報告的變化都被保存了。l 在文件名框（視窗）或名字框（蘋果計算機(jī)）中給序列命名。保存MegAlign文件l 從文件菜單，選保存。l 最終的報告如左圖顯示。l 選定“Strength.”框。其他的菜單不變：When all match； the template residue 和 show the template residue。l 下面有4個下拉菜單。l 從OPTIONS MENU，選擇New Consensus打開右邊的對話框。當(dāng)在某個位置上，任何一個序列的殘基與其他序列不一樣時，一致序列就會以星號表示。Consensi是一致序列的另外一種圖形展示方法，可以用來標(biāo)志ambiguous殘基。l 距離單位框不變，為“0.”。選擇第一個下拉菜單中的“Shade“后，會激活其下面的另外兩個下拉式菜單。選擇第一個下拉菜單中的“Shade“，中間菜單的“residues differing from”。l 在題目框中，輸入類似“Shade disagreements with consensus.”的名字。在這節(jié)中，我們將給那些與一致序列不一致的氨基酸加陰影。創(chuàng)建Decorations和Consensi另外，我們可以通過加入“decorations”和“consensi.”來優(yōu)化展示的效果。從OPTIONS MENU中選擇Alignment Report Contents打開右面的窗口，選定第37和第9個方框，其它不變。l 通過VIEW MENU中的隊(duì)列報告命令（Alignment Report）打開報告窗口。l 為了繼續(xù)這入門，關(guān)上Phylogenetic Tree窗口。l 為了用cladogram查看結(jié)果，單擊Unbalanced Branches調(diào)色板工具（從頂端第4）。默認(rèn)為Balanced Branches調(diào)色板（從頂端第3）。l 為了繼續(xù)，關(guān)上Residue Substitutions and Sequence Distances窗口。l 通過VIEW MENU中的Sequence Distanc查看序列的差別和相似性（如左）。l 隊(duì)列進(jìn)程窗顯示比較完成的百分比?，F(xiàn)在我們可以比較我們的calmodulin序列了。l 從上面的下拉菜單選擇Structural。我們的序列是蛋白質(zhì)，并且我們將使用Jotun Hein方法，所以“Structural”表是最好的選擇。在我們實(shí)行隊(duì)列之前，我們應(yīng)該選擇一個權(quán)重表。如果已知序列有一定的同源性，我們推薦使用Jotun Hein，并且，如果有關(guān)序列相關(guān)性的背景未知，可以選擇Clustal。l 從OPTIONS MENU，使用Size命令增加字體大小到看得清楚為止。首先，我們要創(chuàng)建一個包括14 calmodulin序列的新文件：l 從文件菜單，選Open打開DNASTAR文件夾的“Demo MegAlign”的文件夾。多序列比較為了在MegAlign中進(jìn)行多序列比較，我們選擇一個含有十四個相關(guān)的鈣調(diào)蛋白序列的文件進(jìn)行操作。從左側(cè)末端開始的紅色斜線，表示兩個序列比較的位置。MegAlign計算結(jié)果會在另一個窗口顯示出來。l 從ALIGN MENU中的One Pairl里選擇Dot Plot打開右面的窗口。使用點(diǎn)劃分方法（Dot Plot Method）點(diǎn)劃分方法是先把要比較的序列疊加起來，然后計算匹配不當(dāng)?shù)臄?shù)目。l 另外，還可以通過選定或不選彩色選擇方框下面的方框查看隊(duì)列窗口中隊(duì)列的變化。所有和一直序列一樣的堿基都立即變成深藍(lán)色。l 單擊隊(duì)列調(diào)色板工具（有“x”方框圖標(biāo)），打開下面的隊(duì)列顏色編輯讀化框。窗標(biāo)題展示相似指數(shù)（所右匹配殘基的百分比），缺口數(shù)目，全的缺口長度和一致序列長度。l 使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比較，點(diǎn)擊OK。l 同時選中兩個序列。我們序列是DNA，我們可以用的方法是WilburLipman，MartinezNeedlemanWunsch和Dotplot。你將自動回到Worktable，這時，設(shè)置后的序列就出現(xiàn)了。下面顯示的是選定序列的特點(diǎn)名字和范圍。l 從OPTIONS MENU，選Set Sequence Limits，接著，從Feature Table打開右面的序列末端設(shè)置窗口。這里，我們將使用histone H2B1的CDS進(jìn)行操作。后者要求每個DNA序列都必須是給出正確的翻譯讀框。序列設(shè)置下面我們練習(xí)subranging輸入的histone序列。l 單擊Done把序列輸入Worktable。單擊TETHIS22，點(diǎn)擊Add鈕。l 從你DNASTAR文件夾中的“Demo MegAlign,”文件夾，雙擊打開“Histone Sequences.”文件夾，左上兩個序列是我們選用的序列。我們將從創(chuàng)建一個MegAlign文件，輸入兩個histone序列開始。配對比較可以比較任何2個選定的序列的相似性，而多序列比較對在Worktable中所有序列進(jìn)行