【正文】 4+的濃度下，細(xì)胞可以大量形成檸檬酸，那么NH4+ 濃度是如何升高的呢？ 進(jìn)一步的研究表明，檸檬酸產(chǎn)生菌——黑曲霉如果生長(zhǎng)在Mn+ 缺乏的培養(yǎng)基中，NH4+濃度異常的高，可達(dá)到25mmol/L，顯然，由于Mn+的缺乏，使得微生物體內(nèi)NH4+濃度升高，進(jìn)而解除了檸檬酸對(duì)PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不斷的合成大量的檸檬酸。 Mn+ 缺乏如何會(huì)使NH4+濃度升高呢？ 當(dāng)培養(yǎng)基中Mn+ 缺乏時(shí)，NH4+濃度升高，同時(shí)微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝關(guān)系可以使用下圖示之： 氨基酸 合成 蛋白質(zhì) 分解 氨基酸 氨基化合成氨基酸 該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環(huán)，大量生成檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過程中仍需要控制它的活性。由于該酶的活性受到Fe2+ 的影響，控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度，可以使該酶失活。因此，檸檬酸發(fā)酵要求采用不銹鋼為反應(yīng)器的材料，目的就是控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度。但是在檸檬酸發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的Fe2+ ，原因目前尚沒有搞清楚。 那么，解決了檸檬酸發(fā)酵過程中的上述幾個(gè)問題：……，是不是就意味著可以將葡萄糖源源不斷的轉(zhuǎn)化成檸檬酸呢？ 提問：根據(jù)微生物代謝調(diào)節(jié)的基本理論，還需要解決什么問題？ 菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經(jīng)過EMP到檸檬酸整個(gè)代謝途徑需要暢通，在這個(gè)過程中，有一步反應(yīng)：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產(chǎn)生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分子的NADH經(jīng)過呼吸鏈徹底氧化成H2O，并氧化磷酸化產(chǎn)生3分子的ATP，造成了微生物體內(nèi)能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關(guān)鍵酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝停止，怎么能夠大量合成檸檬酸呢？如果NADH（還原型）不能夠快速的被氧化轉(zhuǎn)變成NAD（氧化型），則整個(gè)反應(yīng)就會(huì)因?yàn)槿狈ψ鳛橥苿?dòng)力的氧化型的NAD而停止，仍然不能夠合成檸檬酸。而實(shí)際上，確實(shí)檸檬酸產(chǎn)生菌可以在有氧的條件下大量生成檸檬酸，也就是說，NADH即被氧化了，又沒有產(chǎn)生ATP。為了解釋這種現(xiàn)象，有人提出了一種假設(shè)：該菌體內(nèi)存在一條側(cè)系呼吸鏈，NAD(P)H經(jīng)過該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒有氧化磷酸化生成ATP，能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈。后來的大量的實(shí)驗(yàn)證明，在某些微生物體內(nèi)確實(shí)存在一條這樣的側(cè)系呼吸鏈，該側(cè)系呼吸鏈中的酶系強(qiáng)烈需氧，如果在檸檬酸的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溶氧濃度在很低的水平維持一段時(shí)間，或者在這期間中斷供氧一段時(shí)間（20分鐘，根據(jù)處理情況如：緊急保壓等）則這一側(cè)系呼吸鏈不可逆的失活，其結(jié)果是菌體不再產(chǎn)酸，而是產(chǎn)生了大量的菌體，因?yàn)?，?biāo)準(zhǔn)呼吸鏈的存在使得菌體在代謝過程中產(chǎn)生了大量的ATP，用于菌體自身的生長(zhǎng)上，這種現(xiàn)象，在生產(chǎn)上通常稱之為：只長(zhǎng)菌不產(chǎn)酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，卻沒有生產(chǎn)出檸檬酸，是一種失敗，（大型檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)需要自己備用的發(fā)電系統(tǒng)）。 理論可以指導(dǎo)實(shí)踐，反過來，通過實(shí)踐可以推動(dòng)理論研究，豐富理論研究成果。 科學(xué)研究過程中的許多基本規(guī)律是相同的，今天，我們?cè)诖髮W(xué)的學(xué)習(xí)，更多的是學(xué)習(xí)一種方法或者說一種思維。通過這個(gè)例子，我們可以學(xué)習(xí)到許多專業(yè)以外的知識(shí)……首先為了解釋一種客觀想象，提出一種假設(shè)，然后通過實(shí)驗(yàn)來證明這種假設(shè)……四、檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率 一個(gè)工業(yè)化的過程，產(chǎn)率問題是必須研究的問題。按照上述檸檬酸發(fā)酵過程中的代謝控制要求，菌體可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化成檸檬酸，但是，如果葡萄糖經(jīng)過EMP途經(jīng)生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下生成了乙酰輔酶A(CH3COCoA)，則合成一分子檸檬酸需要3分子的CH3COCoA，；試想，如果其中一分子的丙酮酸通過CO2固定反應(yīng)生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的檸檬酸需要1分子的葡萄糖，產(chǎn)率可以大大的提高。 192 /( 180*) == % CO2固定反應(yīng)提供C4二羧酸 192 / 180 == % C6H12O6 C6H8O7 (C沒有增加) 可見，CO2固定反應(yīng)堆與檸檬酸發(fā)酵的重要性。在檸檬酸產(chǎn)生菌內(nèi)，存在下列CO2固定反應(yīng)： （1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 == 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 （2）丙酮酸 + CO2 === 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶 以上兩種CO2固定反應(yīng)所需要的輔酶都是生物素。 總之： 在檸檬酸發(fā)酵過程中，存在三個(gè)控制要點(diǎn)： C6H12O6 控制Mn+ NH4+濃度，解除檸檬酸讀對(duì)PFK的抑制（1）點(diǎn)：EMP暢通無阻 控制溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ? 丙酮酸 + 丙酮酸 （2）點(diǎn)：通過CO2固定反應(yīng)生成C4二羧酸，強(qiáng)化這一反應(yīng)的方法： 乙酰輔酶A + C4二羧酸 檸檬酸 （3）點(diǎn)：檸檬酸后述的酶的酶活性喪失或很低，控制培養(yǎng)基中的Fe2+ 的濃度五、檸檬酸產(chǎn)生菌的育種 檸檬酸發(fā)酵和其他代謝控制發(fā)酵一樣，都是在環(huán)境水平上的代謝控制發(fā)酵，亦即，選育有代謝技能的突變株，在有控制的培養(yǎng)基上，在有選擇的條件下，才能大量合成產(chǎn)物。因此菌種的選育是非常重要的，根據(jù)菌種選育的方法不同可以分為：分子生物學(xué)水平上的、傳統(tǒng)的。 分子生物學(xué)水平：選定特定的基因（需要大量的基礎(chǔ)工作） 加在？某一載體上（宿主細(xì)胞，Host） 在特定的條件下的基因表達(dá) 今天介紹的是傳統(tǒng)的方法： 平板：10%甘薯 + 2 %的瓊脂 + % CaCO3 誘變后，涂布，透明圈大的則好，為何？淀粉的水解能力。 平板：麥汁培養(yǎng)基 + pH值指示劑 誘變后，33℃培養(yǎng)3天，透明圈大的則好。 不利用檸檬酸為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株，說明其TCA循環(huán)中檸檬酸后述的酶的活性較低，或者喪失，這有利于檸檬酸的積累。方法：以檸檬酸為唯一的碳源的培養(yǎng)基上，選擇生長(zhǎng)不好的突變株。 、少長(zhǎng)孢子、遲長(zhǎng)孢子的菌株 在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會(huì)使TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。（為何？中間產(chǎn)物少，C架少，不利于合成代謝……）167。43 GA的生物合成機(jī)制與代謝調(diào)節(jié) GA發(fā)酵作為重點(diǎn)：（1）是代謝控制發(fā)酵的重點(diǎn) （2）是目前代謝控制發(fā)酵中，在理論與實(shí)踐上最成熟的……一、GA 的生物合成途徑主要有：Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán) 乙醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán) CO2固定反應(yīng) αKGA的還原氨基化 這6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示： C6H12O6 HMP3磷酸甘油醛 乳酸 丙 酮 酸 乙酰輔酶A CO2 草酰乙酸 檸 檬 酸 蘋果酸異檸檬酸 延胡索酸 琥珀酸 NADPH α—KGA NADPH NH4+ 谷氨酸二、GA生物合成的內(nèi)在因素從上圖可以看出，菌體要在葡萄糖含量10%以上的培養(yǎng)基上，合成5%以上的谷氨酸，是一種不正常的現(xiàn)象，顯然GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件：—KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失 這是菌體生成并積累α—KGA的關(guān)鍵，從上圖可以看出，α—KGA是菌體進(jìn)行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在α—KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)他的濃度很低，也就是說，由α—KGA進(jìn)行還原氨基化生成GA的可能性很少。只有當(dāng)體內(nèi)α—KGA脫氫酶活性很低時(shí)，TCA循環(huán)才能夠停止，α—KGA才得以積累。 （1）如上圖所示，NADPH是α—KGA還原氨基化生成GA必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián) 的。 （2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH對(duì)于抑制α—KGA的脫羧氧化有一定的意義。（DCA）的關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶。 該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱為別構(gòu)酶，其活性可以通過某種方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過該酶酶活性的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，DCA 循環(huán)的封閉是實(shí)現(xiàn)GA 發(fā)酵的首要條件。關(guān)于該酶的酶活性的調(diào)節(jié)后述?！劝彼崦摎涿富钚? α—KGA + NH4+ +NADPH == GA + NADP L—谷氨酸脫氫酶，實(shí)質(zhì)上GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強(qiáng) 該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)，反應(yīng)機(jī)制如下： α—KGA NADPH α—KGA GA NADP 異檸檬酸三、GA 生物合成的最理想途徑 上述涉及到的GA生物合成途徑很多，那GA 生物合成由哪幾條途徑合成是最為理想的呢？ 通過比較來說明這一問題：1. 在前述GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）體系不存在CO2固定反應(yīng)，則有： 3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A 檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）谷氨酸 則有： 3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 產(chǎn)率：147 /（180*3/2） == % 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應(yīng)，則有： Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 CO2 草酰乙酸 （草酰乙酸羧化酶）乙酰輔酶A + C4二羧酸蘋果酸（蘋果酸激酶） 檸檬酸（DCA循環(huán)封閉） 谷氨酸 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 產(chǎn)率：147 / 180 == %可見，在GA的生物合成過程中，CO2固定反應(yīng)對(duì)于產(chǎn)率的提高有著多么重要的作用。在許多微生物發(fā)酵的過程中，通常需要檢測(cè)反應(yīng)器尾氣的組成，特別是尾氣中CO2的含量，其主要目的就在于分析產(chǎn)物合成期間菌體的代謝途徑，有利于指導(dǎo)生產(chǎn)。在GA產(chǎn)生菌菌體內(nèi)CO2固定反應(yīng)有以下兩條途徑：（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP(2) 蘋果酸合成酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH === 蘋果酸 + NAD 需要Mn+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充Mn+實(shí)際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來自于CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在CO2固定反應(yīng)，因此，GA 發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在：%——%。目前，國(guó)內(nèi)的GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在50%以內(nèi)：（1）企業(yè)計(jì)算的糖酸轉(zhuǎn)化率是把GA 發(fā)酵前期菌體增殖時(shí)期消耗的葡萄糖計(jì)算在內(nèi)，而我們所計(jì)算的不包括這一部分葡萄糖，通常這一部分糖占總量的20%左右，當(dāng)然與企業(yè)的技術(shù)水平有關(guān)。（2）TCA 循環(huán)也不可能完全封閉；α—KGA也不可能完全轉(zhuǎn)化為GA；生成的GA也不可能完全分泌的細(xì)胞外；發(fā)酵液中還存在一定的殘?zhí)疲?——%之間。 無論如何，提高GA的潛力仍然是很大的，具體表現(xiàn)在： （1）強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)，具體措施：Mn+ ，生物素？ （2）控制溶氧濃度是非常重要的 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化……