【導(dǎo)讀】基質(zhì)，如蘑菇菌是有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型中的草腐生菌。制備培養(yǎng)基不僅要考慮它所需要的。還應(yīng)考慮它們培養(yǎng)方式是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)。需要比例配制的滅菌營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基。換言之，培養(yǎng)基必須具備三個(gè)條件：。目的要求有所不同，所選用的培養(yǎng)基的配比也應(yīng)有所區(qū)別。一般母種初生菌絲較。嫩弱，分解養(yǎng)分能力差，要求營(yíng)養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應(yīng)高。作物秸稈、糞草、棉籽殼、麩皮、米糠等原料作為培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基來(lái)源廣，成本低，營(yíng)養(yǎng)豐富，適合于在生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)菌類使用，以分離馴化食用菌培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基種類繁多，應(yīng)用廣泛，也是生長(zhǎng)菌種和實(shí)際栽培最常用的培。這類培養(yǎng)基組成和含量明確，價(jià)格較貴，液體培養(yǎng)基可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)源的篩選實(shí)驗(yàn)，以及生理生化方面如酶活力等。加適量的無(wú)機(jī)鹽類等制成固體培養(yǎng)基，現(xiàn)將常用的培養(yǎng)基配方介紹如下。直至生化瓜停止而終止生命。此外高溫尚可破壞細(xì)胞的其他組成，或者使細(xì)胞的脂肪膜受熱溶解而

　　

【正文】 方法中進(jìn)行擴(kuò)和移接，確保菌種能長(zhǎng)期保持該品種的原有優(yōu)良性狀。 （４）創(chuàng)造菌種生長(zhǎng)良好營(yíng)養(yǎng)條件和外界環(huán)境 菌種培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件應(yīng)適宜，才能使菌種生長(zhǎng)健壯，減少退化的發(fā)生。營(yíng)養(yǎng)不足和過(guò)于豐富對(duì)菌種生長(zhǎng)均不利。菌種的生長(zhǎng)繁殖受到物理、化學(xué)、生物等外界條件的影響，如條件適宜，菌種生長(zhǎng)正常，不易退化，不相適宜，則會(huì)引起菌種的退化。比如芳香族化 合物，能誘發(fā)絨毛狀菌絲體成扇形菌落的形成，這種菌絲體在料床上易形成致密的白斑，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。 （５）對(duì)菌種可能遭受病毒的感染應(yīng)保持足夠的警惕。對(duì)有疑問(wèn)的菌種要及時(shí)檢驗(yàn)。確證已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌絲體及子實(shí)體性狀已受到嚴(yán)重影響的菌種，應(yīng)及時(shí)淘汰。 ４、菌種的復(fù)壯 （１）菌絲尖端分離進(jìn)行提純復(fù)壯，在顯微鏡下應(yīng)用顯微操作器把菌絲尖端切下轉(zhuǎn)移至新瓶的 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這樣可以保證該菌種的純度， 并且可以起到脫病毒的作用，使菌種保持原有品種的遺傳物質(zhì)，恢復(fù)原來(lái)的生活力和優(yōu)良種性，達(dá)到復(fù)壯的目的。 （２ ）適當(dāng)更換培養(yǎng)基，長(zhǎng)期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，生活力可能逐漸下降。將碳源、氮源、碳氮比、維生素、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)作適當(dāng)調(diào)整，對(duì)因營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不適而衰退的菌種，有一定的復(fù)壯作用。 （３）菌種分離，要有計(jì)劃的把無(wú)性繁殖和有性繁殖的方法交替使用，反復(fù)進(jìn)行無(wú)性繁殖菌種會(huì)不斷衰退，而經(jīng)有性繁殖所產(chǎn)生的孢子，是食用菌生活史的起點(diǎn)，具有豐富的遺傳特性，因此必須定期進(jìn)行蘑菇菌株的單孢分離篩選，從中優(yōu)選出具有該品種原來(lái)優(yōu)良性狀的新菌株，逐漸替代舊菌株，這樣就可不斷地使該品種得到恢復(fù)，長(zhǎng)期使用。 一、概述 蘑菇菌種和其它微生 物一樣，都具有穩(wěn)定遺傳性和變異性。遺傳性，保證微生物本身特征的相對(duì)穩(wěn)定，即無(wú)性繁殖過(guò)程中能夠保持原有的性狀，為菌種保藏提供了有利因此，而變異性，使微生物的性狀在繁殖過(guò)程中出現(xiàn)某些改變，給菌種保藏帶來(lái)了困難。由于存在變異，即菌種常出現(xiàn)所謂的退化，主要指理想性狀的喪失，從而導(dǎo)致發(fā)育緩慢，存活率和產(chǎn)質(zhì)量降低等現(xiàn)象，菌種保藏工作就是使菌種的變異降低至最小水平，使菌種在較長(zhǎng)期的保藏之后仍然保持著原有的生命力、優(yōu)良生產(chǎn)性能、形態(tài)特征以及不污染雜菌和發(fā)生蟲害。能夠長(zhǎng)期在生產(chǎn)上和研究上應(yīng)用。 微生物的變異速度，通常情況下， 與其新陳代謝速度有關(guān)，微生物代謝活力旺盛，它的變異速度快，代謝活動(dòng)微弱，變異速度就慢。并且在多次的無(wú)性繁殖過(guò)程中可能會(huì)有突變的積累。人們利用這一規(guī)律，可以創(chuàng)造各種條件，使微生物活動(dòng)處于微弱活動(dòng)或不活動(dòng)狀態(tài)，以減少變異的發(fā)生。菌種保藏的原理是：通過(guò)低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營(yíng)養(yǎng)等手段，以達(dá)到最大限度地降低菌種的代謝強(qiáng)度，抑制菌絲的生長(zhǎng)和繁殖。由于菌種的代謝相對(duì)靜止，生命活動(dòng)將處休眠狀態(tài)，從而可以保藏較長(zhǎng)時(shí)間。 二、保藏方法 （一）斜面冰箱保藏法 這是蘑菇菌種的一種短期保存法，因?yàn)樗?jiǎn)單易行，不需特殊設(shè)備，并能 隨時(shí)觀察保藏菌種的情況，因此也是常用的菌種保藏方法。 １、保藏方法 蘑菇菌種斜面冰箱保種一般使用 PDA 斜面培養(yǎng)基即可。菌種移接后，放在 2224℃ 溫度下培養(yǎng) ,要勤檢查 ,當(dāng)菌絲健壯地長(zhǎng)滿試管時(shí) ,及時(shí)挑選無(wú)污染的培養(yǎng)斜面 ,棉塞用硫酸紙包扎后放置在4℃ 的冰箱中保藏。一般 23 個(gè)月轉(zhuǎn)管一次。 ２、注意事項(xiàng)：由于斜面冰箱保藏是在 4℃ 下進(jìn)行 ,微生物單孢分離物活動(dòng)并未停止 ,需要經(jīng)常轉(zhuǎn)管移接 ,因此對(duì)于保藏所用的斜面菌種質(zhì)量要求較高，其菌絲形態(tài)、菌落特征應(yīng)保持原有特性，操作人員必須對(duì)斜面菌種質(zhì)量應(yīng)具有有一定的鑒別能力，所挑選 的菌種才能適合保藏，其次菌種的菌齡不能太幼也不能太老，否則冰箱保藏后轉(zhuǎn)管擴(kuò)接易造成退化。再則冰箱溫度應(yīng)控制在 24℃ 之間 ,盡量恒溫使菌絲體處于穩(wěn)定的生理狀態(tài)。 （二）糞草管冰箱保藏法 １、保藏方法：糞草管的培養(yǎng)基是由腐熟麥稈粉 100,腐熟牛糞粉 25,麩皮 8, 石膏粉 1%,碳酸鈣 2%,含水量 65%左右 , 制備而成 ,調(diào)配后裝入試管中 ,經(jīng)高壓滅菌后 ,接入菌種塊 ,放在 2224℃ 溫度下培養(yǎng)。要勤檢查是否有污染，當(dāng)菌絲健壯地長(zhǎng)滿草基試管時(shí)，及時(shí)挑選生長(zhǎng)正常無(wú)污染的試管，棉塞頭用硫酸紙包扎后放置在 24 ℃ 的冰 箱中 ,該保藏方法為中期保藏，一般 23 年轉(zhuǎn)管一次。 ２、注意事項(xiàng)：由于糞草管可保藏 23 年時(shí)間 ,因此如何防止糞草管的水分損失是該保藏方法時(shí)間長(zhǎng)短的關(guān)鍵所在 ,一方面培養(yǎng)基含水量不能低于 62%, 另一方面棉塞用硫酸紙包扎后可加些蠟進(jìn)行封口 ,防止水分蒸發(fā)。 再則有條件應(yīng)把試管保藏在具有保濕的冰柜或冰庫(kù)中，溫度控制在 24℃ ,濕度控制在90%左右。 （三）液體石蠟保藏方法 液體石蠟防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，隔絕斜面菌絲與 空氣接觸，抑制菌絲的單孢分離物，可能使其處于休眠狀態(tài)，推遲細(xì)胞衰老，延長(zhǎng)菌絲的保藏，一般可保藏 57 年，是一種中長(zhǎng)期的菌種保藏方法。 １、保藏方法：液蠟保藏蘑菇菌種的培養(yǎng)基為 PDA 斜面即可。將菌種塊移接到 PDA 斜面上 ,在 2224℃下培養(yǎng) 1520 天 ,然后用液體石蠟封藏保存。液體石蠟要選化學(xué)純的，在 121℃ 下高壓滅菌 30 分鐘 ,再將液體石蠟在 160℃ 烘箱中加熱 12 小時(shí)。亦可將高壓滅菌后的液體石蠟放置在 4060℃ 溫箱中 ,使滅菌后的液體石蠟層出現(xiàn)乳白色直至變成完全透明的無(wú)色為止 ,目的是將高壓滅菌時(shí)侵入液體石蠟中的水蒸發(fā)干凈。 將滅菌除水的液體石蠟用無(wú)菌吸管罐到長(zhǎng)滿菌絲的斜面試管中，液體石蠟要高出斜面尖端 厘米左右，然后用無(wú)毒泡沫試管塞塞好，置室溫中保藏。 ２、注意事項(xiàng)：菌絲的培養(yǎng)時(shí)間不能太短，為防止菌絲體的進(jìn)一步發(fā)育，可適當(dāng)延長(zhǎng)菌齡或讓試管先置在冰箱中 (24℃ )2 天后再加入液體石蠟。倒入的液體石蠟要超過(guò)斜面尖端 厘米左右 ,如過(guò)低液體石蠟揮發(fā)后會(huì)露出斜面 , 從而導(dǎo)致斜面培養(yǎng)基的干涸 ,縮短了保藏時(shí)間。烘烤液體石蠟應(yīng)乇底，盡可能把水分蒸發(fā)干凈， 防止水蒸汽蒸發(fā)導(dǎo)致棉花塞潮濕長(zhǎng)霉而影響菌種的保藏。 （四）濾紙保藏法 將蘑菇孢子吸附在濾紙條上，干燥后放入冰箱進(jìn)行保藏，由于該保藏是有性的孢子，一般不用于生產(chǎn)中， 主要是起到保藏種質(zhì)資源的作用及菌種的選育，根據(jù)福建省蘑菇菌種研究推廣站的濾紙孢子保藏試驗(yàn)，用該方法已保藏蘑菇菌種達(dá) 10 年以上 ,孢子成活率約為 5080%之間。 １、保藏方法：孢子收集方法同單孢子分離的孢子收集，當(dāng)濾紙條上收到有相當(dāng)數(shù)量孢子后，用無(wú)菌鑷子將濾紙條無(wú)菌操作放入無(wú)菌試管中，將該試管放在抽真空的干燥器中 12 天 ,除去濾紙條上水分使之充分干燥 ,隨后把試管口封好 ,粘好標(biāo)簽 , 放在冰箱中保藏。 （五）真空冷凍干燥保藏法 真空冷凍干燥簡(jiǎn)稱凍干。這種方法是利用低溫使孢子先冷凍，然后再在真空條件下，使孢子中的水 分升華排出，孢子處于休眠狀態(tài)，但仍保持原有活力，是一種長(zhǎng)期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具體操作如下。 （１）選用內(nèi)徑 8mm,長(zhǎng) 120mm 的中性玻璃管作為制安瓿管的材料。將玻管用 2% 鹽酸浸泡 810 小時(shí) ,再用蒸餾水洗 23 次后 ,置烘箱中烘干。將印有菌號(hào)、編號(hào)、 制作日期的標(biāo)簽放入安瓿管中，塞好棉塞，進(jìn)行干熱滅菌。 （２）用接種鏟將收集的蘑菇孢子鏟入盛有 3ml 無(wú)菌脫脂牛奶的試管中 ,稍加搖動(dòng) , 制成孢子懸浮液。用無(wú)菌吸管將孢子懸浮液移入安瓿管的球形部分，每管約 ,然后將管口通過(guò)火焰 ,用無(wú)菌鑷子取少許無(wú)菌棉花 塞于安瓿管口。 （３）將安瓿管放入無(wú)水乙醇與干冰混合的凍裝置，溫度可達(dá) 65～ 70℃ 預(yù)凍 5 分鐘左右 ,也可在低溫冰箱 (40)預(yù)凍 3060 分鐘。然后取出放入真空干燥器中， 用高真空活塞油封好立即抽真空，并隨時(shí)用真空火花檢漏儀檢查真空度，發(fā)現(xiàn)有微小漏氣處，要迅速用真空泥涂住。一般真空度應(yīng)維持在 千帕以下 ,如抽真空 10 分鐘后仍達(dá)不到此真空度 ,說(shuō)明真空系統(tǒng)不佳 ,可能會(huì)造成融化而失敗。真空干燥器外面用 1:3 的鹽冰水保溫 ,其效果會(huì)好些 ,真空度穩(wěn)定 ,一般抽 78 小時(shí) ,可完全將安瓿瓶中水升華至干。此時(shí)應(yīng)關(guān)閉緩 沖瓶前的三道閥門，然后再斷電。抽干后的安瓿瓶顏色應(yīng)是白色，如果淺黃色或不成凹狀，多數(shù)都因?yàn)檎婵斩冗_(dá)不到要求而造成融化失敗的結(jié)果。 （４）凍干好的安瓿瓶要進(jìn)行真空熔封?？捎靡粋€(gè)頂端多歧管或一個(gè)Ｚ型管，每個(gè)分支口都接入真空橡皮管以便將安瓿管接在橡皮管內(nèi)，然后抽真空，邊抽真空邊用煤氣噴燈熔封。熔封的安瓿 瓶要進(jìn)行檢漏，可用高真空火花檢漏儀檢查。安瓿瓶?jī)?nèi)呈藍(lán)色熒光，說(shuō)明真空封口良好，也可用微帶紅或藍(lán)的清水浸泡安瓿瓶，經(jīng)一晝夜安瓿瓶?jī)?nèi)無(wú)顏色水浸入，則為封口合格。 （５）菌種安瓿瓶經(jīng)無(wú)菌檢查和存活率檢查合格后，置 28℃ 冰箱內(nèi)保藏 ,一般蘑菇菌種可保藏 810年。 （６）復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)，可在開啟的安瓿管內(nèi)注入 的無(wú)菌生理鹽水或 1% 麥芽汁。菌種安瓿瓶開啟時(shí)，應(yīng)先將安瓿瓶的封端加熱，在浸有來(lái)蘇爾等消毒液的濕布上擦一下，使管壁形成裂縫，然后再輕輕敲碎。切忌猛烈割斷，以免空氣驟然沖入，導(dǎo)致污染。安瓿瓶加入生理鹽水后菌種即自行溶化，搖動(dòng)后即成孢子懸浮液，可接入 PDA 培養(yǎng)基上 ,進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。 （六）液氮超低溫保藏法 液氮超低溫保種是把菌種裝在含有冷凍保護(hù)劑的安瓿瓶?jī)?nèi)，將該安瓿瓶放入液氮 (196℃ )中進(jìn)行保藏 ,由于菌絲體 處于 196℃ ,其代謝降低到完全停止的狀態(tài)。所以不需定期移植。從理論上講，菌絲體可以無(wú)限期地存活。蘑菇菌種的液氮保種從 1970 年開始進(jìn)行試驗(yàn) ,至今已有 20 多年的歷史 ,經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)證明液氮保種是菌種長(zhǎng)期保藏的最有效最可靠的方法。隨著方法的不斷改良，現(xiàn)人介紹近年來(lái)應(yīng)用的一種最簡(jiǎn)便的液氮保種方法。 （１）菌種制備 菌種在 PDA培養(yǎng)基平板上于 2224℃ 下培養(yǎng) 1015天 ,菌絲體充分生長(zhǎng)后 ,用打孔器 (直徑 24mm)打成小孔 ,或用接種針把菌絲培養(yǎng)物切成 24mm 長(zhǎng)方形小塊。 （２）安瓿管的制備 把直徑 46mm 的聚乙烯塑料管（也可用飲料吸管）截成小段做成安瓿管。每節(jié)大約 60mm 長(zhǎng) ,一頭用熱合機(jī)封好。然后用牛皮紙包裝進(jìn)行 121℃ 下高壓滅菌 30 分鐘。 （３）保護(hù)劑 10%的甘油水溶液進(jìn)行 121℃ 下高壓滅菌 30 分鐘可作為冷凍保護(hù)劑。用量為每安瓿上留有 510mm 的空間 ,用無(wú)菌注射器從管底注入 ,以防產(chǎn)生氣泡。隨后，且無(wú)菌接種針從安瓿管口放入 58塊菌種塊，熱合封好安瓿。 用記號(hào)筆在發(fā)瓿管外寫上標(biāo)簽，最后在桌 上用一定的力按 壓，以檢查安瓿是否滲漏。 （４）液氮保藏 把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶 的底部放一塊鐵片，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細(xì)繩并作記號(hào)，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約 30 分鐘后 ,把 按瓿管浸入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。 （５）恢復(fù)培養(yǎng) 如果擬取用液氮保存的菌種，可將安瓿管取出后立即放入 3540℃ 的溫水中迅速解凍 ,為了防止污染 ,用 75%酒精洗安瓿管表面 ,表面干燥后 , 用火焰燒過(guò)的剪刀在安瓿的一端剪開 ,用無(wú)菌接種針把菌塊移接至 PDA 培養(yǎng)基上 ,置 2224℃ 培養(yǎng)。