【正文】 種室（箱）臺(tái)面上不同位置打開置放的平皿， 其中一組不打開平皿蓋作為對(duì)照，開蓋平皿放置５分鐘，然后蓋上蓋，與對(duì)照組同時(shí)在 30℃ 培養(yǎng) 72 小時(shí) ,檢查在平皿培養(yǎng)基上是否有霉菌菌落。 （一）培養(yǎng)基滅菌效果檢驗(yàn) １、 試管母種培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，從高壓滅菌鍋中不同部位隨機(jī)抽取５支，放置 28177?；瘜W(xué)名稱為十二烷基溴化胺，淡黃色，有香味的膠狀體。 常用的表面消毒劑是二氯化示，又名升汞。 5%與 10%碘化鉀水溶液也是皮膚有效的消毒劑。 （１）高錳酸鉀 強(qiáng)氧化劑， 1:1000 與 1:1250 的濃度都具有殺菌作用。起殺菌作用的是熟石灰中的氫氧根離子，能水解蛋白質(zhì)和核酸，使微生物的酶系和結(jié)構(gòu)受到損害，并能分解菌體中的糖類。 ４、酚及其衍生物 常用的是石碳酸，又名苯酚，純品為無色或白色針狀、塊狀或三棱形晶體，溶于水，具特殊氣味。 ３、乙醇類 乙醇又稱為酒精。 ２、硫磺及其熏蒸滅菌方法 商品硫磺為有光澤的淡黃色粉末（或碎塊），不溶于水，熔點(diǎn)為 363℃ ,燃燒后生成二氧化硫。 使用方法有加熱熏蒸法，即利用福爾馬林沸點(diǎn) 96!0 的特點(diǎn)，將福爾馬林置于玻璃、陶瓷或金屬容器中，用酒精燈或電爐加熱，藥液蒸發(fā)完，立即撤去熱源。香菇生產(chǎn)中常用的化學(xué)藥品及具體使用方法如下。由于紫外線穿透物質(zhì)的能力很差，一層普通玻璃或水，均能濾去大量的紫外線，所以只適用于空氣和物體表面的滅菌，一般要求紫外燈距離照射物不超過 米 為宜，接種室和接種箱常用紫外燈作為空氣和桌面的消毒。干熱滅菌適用于固體材料滅菌，不適用于液體材料滅菌。欲殺死培養(yǎng)基的芽胞， 可將其在流通蒸汽中消毒 2030 分鐘 ,先殺死其中的營養(yǎng)體細(xì)胞 ,然后將培養(yǎng)基在室溫或溫箱中培養(yǎng) ,使芽孢發(fā)芽長成營養(yǎng)體 ,再用流通蒸汽消毒 2030 分鐘 ,殺死新長成的營養(yǎng)體細(xì)胞 ,這樣連續(xù) 3 次 ,即可殺死培養(yǎng)基中 的全部芽孢 ,達(dá)到無菌狀態(tài)。阿諾氏 (Arnold)流通蒸汽滅菌器是微生物技術(shù)中常用的設(shè)備。高壓蒸汽滅菌結(jié)束后的排汽降壓不能太快，若排汽太快，瓶內(nèi)外的壓力差 就會(huì)增大，引 起瓶塞沖出瓶口；液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，液體會(huì)突然沸騰，弄臟瓶塞；塑料袋裝培養(yǎng)料滅菌時(shí)，應(yīng)讓其自然冷卻，當(dāng)壓力下降到 ，再打開排氣閥放氣，以免在減壓過程中，袋內(nèi)外產(chǎn)生壓力差，把塑料袋擊穿，導(dǎo)致以后雜菌污染。 排除冷空氣的方法有兩種：緩慢排氣和集中排氣。蒸汽壓力與蒸汽溫度的關(guān)系見下表。 熱力滅菌經(jīng)濟(jì)有效，簡便易行， 是最普遍采用的方法，它可以分為濕熱滅菌和干熱滅菌兩種。 １、熱力滅菌 利用高潮殺死微生物的方法，稱為熱力滅菌。 二、一級(jí)種培養(yǎng)基 一級(jí)種又稱母種，其培養(yǎng)基一般用試管作為容器，所以又稱試管斜面培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基又常用于菌種分離提純，擴(kuò)大，轉(zhuǎn)管及菌種保存等，下面列舉蘑菇菌種生產(chǎn)常用配方。這類培養(yǎng)基組成和含量明確，價(jià)格較貴，一般用于在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)做有關(guān)營養(yǎng)、代謝、菌種鑒定等有關(guān)于食用菌的生理生化研究。一般母種初生菌絲較嫩弱，分解養(yǎng)分能力差，要求營養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應(yīng)高。因此，可以把按菌類生長發(fā)育需要比例配制的滅菌營養(yǎng)基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基。以分離馴化食用菌培養(yǎng)基 （２）半合成培養(yǎng)基 為了促進(jìn)食用菌菌絲的生長發(fā)育，常 在天然培養(yǎng)基中添加適量的無機(jī)鹽類，或在合成培養(yǎng)基中添加適量的某些天然有機(jī)物，就成為半合成培養(yǎng)基。利用這種斜面試管可保藏及擴(kuò)大菌種，同時(shí)亦可制成各種平皿固化培養(yǎng)基分離菌種。就食用菌菌種生產(chǎn)而言，消毒是指用物理或化學(xué)方法殺滅或消除對(duì)食用 菌生長發(fā)育有害的微生物，通常只能消滅物體表面或環(huán)境中的一部分微生物，有能達(dá)到消滅所有微生物。在同樣溫度條件下，熱死溫度高的微生物，其熱死速度慢，熱死溫度低的微生物，其熱死速度快。高壓蒸汽滅菌可以殺死一切微生物，包括細(xì)菌的芽孢，真菌的孢子或休眠體等耐高溫的個(gè)體。 使用高壓蒸汽滅菌時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： ａ、滅菌鍋內(nèi)的冷氣必須排盡。滅菌鍋內(nèi)蒸汽是否暢通，關(guān)系到滅菌溫度是否均一。滅菌結(jié)束時(shí)，應(yīng)先排放鍋內(nèi)熱水，然后再慢慢排放蒸汽降壓。缺點(diǎn)是滅菌時(shí)間長，能源消耗量大，稍不注意就有滅菌不徹底的現(xiàn)象發(fā)生。耐熱的接種環(huán)、接種鏟、接種匙、接種針等，通過火焰灼燒，可徹底滅菌，試管口和玻璃瓶口，通過幾次火焰，溫度可達(dá) 200℃ 以上，一切微生物和芽孢，可全部殺死，達(dá)到無菌程度。 紫外線滅菌 紫外線是非電離輻射，波長 為 136400 納米，以波長 265266 納米的殺菌為最強(qiáng)。因此，化學(xué)藥品可超到殺菌作用或抑菌作用。并對(duì)真菌孢子及營養(yǎng)體均有極強(qiáng)的殺傷力 ,不受有機(jī)物 質(zhì)的影響。 有必要驅(qū)除室內(nèi)甲醛氣味時(shí)，可向室內(nèi)噴灑氨水，氨水濃度為 2528%, 噴的霧滴越小越好 ,噴氨水的量為熏蒸甲醛的一半 ,約 30分鐘左右 ,氨水與空氣中殘存甲醛結(jié)合 ,形成白色無臭粉末。二氧化硫?qū)w維及金屬物品有腐蝕作用，因此，熏蒸房屋時(shí)應(yīng)撤出易腐蝕物品。乙醇只會(huì)殺死細(xì)菌營養(yǎng)體，在香菇生產(chǎn)中，多用于接種時(shí)手的皮膚及器械殺菌。石碳酸水溶液濃度大時(shí)是致死因子；反之，則起抑菌作用。菌筒或菌磚上發(fā)現(xiàn)霉菌污染時(shí)，也可將生石灰直接撒到污染菌面上，殺菌效果良好。高錳酸鉀對(duì)霉菌殺傷效果很差。使用時(shí)將１克高效漂白粉溶于１升水中， 靜放１小時(shí)左右，取其上清液噴霧滅菌。 ８、表面活性劑 具有降低表面張力的物質(zhì)稱為表面活性劑。 表面活性劑的殺菌機(jī)理是改變細(xì)胞透性，使菌全破裂；聚集在菌體表面時(shí)，影響細(xì)胞代謝，破壞細(xì)胞蛋白與酶的活性。上述抽取的樣品，分別在無菌下取出少量培養(yǎng)基接入細(xì)菌培養(yǎng)基，然后在 37℃ 培養(yǎng) 24小時(shí)，檢查結(jié)果沒有細(xì)菌菌落產(chǎn)生，說明滅菌徹底。細(xì)菌在培養(yǎng) 2428 小時(shí)后觀察， 霉菌在培養(yǎng) 72 小時(shí)后觀察 ,實(shí)驗(yàn)組均不長任何菌落 ,視接種室、箱滅菌良好。隨后用無菌刀切掉多余菌柄（約留下 即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖 所示）。 ２、單孢分離 就是將采集到的孢子群單個(gè)分開進(jìn)行培養(yǎng)，讓它單獨(dú)萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。 ② 毛細(xì)滴管制備 :取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑 1 毫米的細(xì)管 , 稍冷卻后再加熱并迅速拉長 ,使管尖內(nèi)徑約 200 微米 ,剪斷即成毛細(xì)滴管 ,在滴管后端塞棉花 , 裝入消毒盒中后進(jìn)行滅菌備用。 （４）單孢子菌落接待：當(dāng)孢子經(jīng)過 10 天的刺激培養(yǎng) , 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落 ,應(yīng)及時(shí)用打孢子器把該菌落分離 ,每天都應(yīng)觀察孢子萌發(fā)情況 , 如果不及時(shí)把菌落移接 ,該菌落會(huì)快速生長而影響較遲萌發(fā)單孢 子的分離。對(duì)于沒有母種生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)缺乏母咱質(zhì)量鑒別能力的制種單位，晝不 進(jìn)行一級(jí)種的生產(chǎn)。 ３、塞棉塞：棉絮可用未經(jīng)脫脂的原棉。隨機(jī)抽取數(shù)根已滅菌的試管培養(yǎng)基放在 2830℃ 下進(jìn)行三天空白培養(yǎng) ,檢查確實(shí)沒有污染雜菌 ,斜面才能正式接種使用。 １、培養(yǎng)基配制 （１）糞草培養(yǎng)基： ① 配方見上述； ② 制作：把發(fā)酵麥稈切短，大約為 35 厘米 ,加入粉碎牛糞粉 ,麩皮 ,石膏 ,碳酸鈣 ,石灰 ,充分拌勻 ,加水調(diào)濕使培養(yǎng)基均勻吸水至含水量達(dá) 65%左右 ,隨后鏟成一堆讓培養(yǎng)基水分平衡 23 小時(shí) ,即可裝瓶。然后在瓶塞邊作深吸氣，聞是否具有蘑菇菌種特有的香味，原種和栽培種可取出小塊菌絲體觀察其顏色和均勻度，并用手指捏料塊檢查含水量是否符合標(biāo)準(zhǔn)。 ６、生理特征測定 蘑菇菌種的生理特征測定包括酶活力測定和遺傳分析兩方面。 （２）有害突變的發(fā)生 一般來說，一個(gè)正常菌株經(jīng)過多代移植，不會(huì)導(dǎo)致遺傳性狀的改變。 （２）控制菌種傳代次數(shù) 菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生變異的機(jī) 率就越高，因此菌種發(fā)生退化的概率就會(huì)越多，生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制菌種的移接代數(shù)。確證已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌絲體及子實(shí)體性狀已受到嚴(yán)重影響的菌種，應(yīng)及時(shí)淘汰。能夠長期在生產(chǎn)上和研究上應(yīng)用。菌種移接后，放在 2224℃ 溫度下培養(yǎng) ,要勤檢查 ,當(dāng)菌絲健壯地長滿試管時(shí) ,及時(shí)挑選無污染的培養(yǎng)斜面 ,棉塞用硫酸紙包扎后放置在4℃ 的冰箱中保藏。 （三）液體石蠟保藏方法 液體石蠟防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，隔絕斜面菌絲與 空氣接觸，抑制菌絲的單孢分離物，可能使其處于休眠狀態(tài)，推遲細(xì)胞衰老，延長菌絲的保藏，一般可保藏 57 年，是一種中長期的菌種保藏方法。烘烤液體石蠟應(yīng)乇底，盡可能把水分蒸發(fā)干凈， 防止水蒸汽蒸發(fā)導(dǎo)致棉花塞潮濕長霉而影響菌種的保藏。 （２）用接種鏟將收集的蘑菇孢子鏟入盛有 3ml 無菌脫脂牛奶的試管中 ,稍加搖動(dòng) , 制成孢子懸浮液。 （４）凍干好的安瓿瓶要進(jìn)行真空熔封。安瓿瓶加入生理鹽水后菌種即自行溶化，搖動(dòng)后即成孢子懸浮液，可接入 PDA 培養(yǎng)基上 ,進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。每節(jié)大約 60mm 長 ,一頭用熱合機(jī)封好。 （５）恢復(fù)培養(yǎng) 如果擬取用液氮保存的菌種，可將安瓿管取出后立即放入 3540℃ 的溫水中迅速解凍 ,為了防止污染 ,用 75%酒精洗安瓿管表面 ,表面干燥后 , 用火焰燒過的剪刀在安瓿的一端剪開 ,用無菌接種針把菌塊移接至 PDA 培養(yǎng)基上 ,置 2224℃ 培養(yǎng)。 （３）保護(hù)劑 10%的甘油水溶液進(jìn)行 121℃ 下高壓滅菌 30 分鐘可作為冷凍保護(hù)劑。所以不需定期移植。熔封的安瓿 瓶要進(jìn)行檢漏，可用高真空火花檢漏儀檢查。 （３）將安瓿管放入無水乙醇與干冰混合的凍裝置，溫度可達(dá) 65～ 70℃ 預(yù)凍 5 分鐘左右 ,也可在低溫冰箱 (40)預(yù)凍 3060 分鐘。 １、保藏方法：孢子收集方法同單孢子分離的孢子收集，當(dāng)濾紙條上收到有相當(dāng)數(shù)量孢子后，用無菌鑷子將濾紙條無菌操作放入無菌試管中，將該試管放在抽真空的干燥器中 12 天 ,除去濾紙條上水分使之充分干燥 ,隨后把試管口封好 ,粘好標(biāo)簽 , 放在冰箱中保藏。將菌種塊移接到 PDA 斜面上 ,在 2224℃下培養(yǎng) 1520 天 ,然后用液體石蠟封藏保存。 ２、注意事項(xiàng)：由于斜面冰箱保藏是在 4℃ 下進(jìn)行 ,微生物單孢分離物活動(dòng)并未停止 ,需要經(jīng)常轉(zhuǎn)管移接 ,因此對(duì)于保藏所用的斜面菌種質(zhì)量要求較高，其菌絲形態(tài)、菌落特征應(yīng)保持原有特性，操作人員必須對(duì)斜面菌種質(zhì)量應(yīng)具有有一定的鑒別能力，所挑選 的菌種才能適合保藏，其次菌種的菌齡不能太幼也不能太老，否則冰箱保藏后轉(zhuǎn)管擴(kuò)接易造成退化。并且在多次的無性繁殖過程中可能會(huì)有突變的積累。 （２ ）適當(dāng)更換培養(yǎng)基，長期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，生活力可能逐漸下降。 （４）創(chuàng)造菌種生長良好營養(yǎng)條件和外界環(huán)境 菌種培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件應(yīng)適宜，才能使菌種生長健壯，減少退化的發(fā)生。那么，隨著移接次數(shù)的增加，有害突變體在菌絲細(xì)胞群中所占的比例會(huì)逐漸增大。 三、菌種的退化與復(fù)壯 １、菌種的退化 菌種在傳代過程中，因遺傳物質(zhì)發(fā)生變異而引起的使原有的優(yōu)良性狀漸漸消失或變壞，出現(xiàn)長勢差、出菇遲、產(chǎn)量不高、質(zhì)量不好、子實(shí)體叢生等現(xiàn)象。也可通過菌絲體染色 后鏡檢觀察。 （３）發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基 ① 配方見上述 ② 制作：棉籽殼 80% ,牛糞粉 20%,石膏 1%,石灰 2%,混勻后加水調(diào)濕含水量達(dá) 70%, 進(jìn)行建堆發(fā)酵 ,堆寬 ,高 ,長度根據(jù)數(shù)量而定 ,當(dāng)料溫達(dá) 6570 ℃ 時(shí)可進(jìn)行翻堆 ,一般 34天翻一次 ,每次翻堆時(shí)應(yīng)補(bǔ)