【正文】 培養(yǎng)基擺成斜面，一般長度的為試管的 2/3 即可 ,擺好斜面后在上面蓋一保溫棉 ,防止試管冷卻過快產(chǎn)生太多的冷凝水。 ４、滅菌：將制好的試管培養(yǎng)基用紗布包扎成一捆，在棉塞上蓋上一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水沾濕棉塞，隨后放入手提式高壓鍋中進行滅菌，滅菌溫度達 121℃ 維持 30 分鐘 ,具體操作要求參照高壓蒸汽滅菌法。棉塞要緊貼管壁不 起皺紋，棉塞塞入管中的部分約為２厘米左右，外露部分約占棉塞總長的 1/3 左右。 ３、塞棉塞：棉絮可用未經(jīng)脫脂的原棉。 ２、分裝 上述制備的母種培養(yǎng)基，趁熱時盡快分裝試管。 （２）綜合馬鈴薯培養(yǎng)基 ① 配方參見上述一級種培養(yǎng)基； ② 制作同 PDA 培養(yǎng)基 ,在加入葡萄糖同時加入磷酸氫二鉀 ,硫酸鎂 ,維生素 B1 等。稱取 200克 ,加水 1000 毫升 ,煮沸后 ,小火保持 30 分鐘。對于沒有母種生產(chǎn)經(jīng)驗缺乏母咱質(zhì)量鑒別能力的制種單位，晝不 進行一級種的生產(chǎn)。一般由自己分離培養(yǎng)獲得的母種，或從專門從事菌種研究部門引進的母種都要進行擴大繁殖，以增加母種數(shù)量，再用于繁殖原種。 ③ 組織分離 :解剖刀經(jīng)火焰滅菌 ,在菇柄中部縱切一刀 , 用手掰開菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個小方塊 ,隨后挑取一小塊組織 ,迅速移接到 PDA 斜面培養(yǎng)基上 ,置 24℃ 下培養(yǎng) ,待組織塊長出菌絲無污染即為純種。組織分離系一種無性繁殖法，雙親的染色體沒有經(jīng)過重組，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡便，取村廣泛，在過去傳統(tǒng)的穩(wěn)定菌株中常采用此方法進行菌種的分離，退化不明顯，但是隨著蘑菇雜交菌種的應用，由于雜種本身所具有的不穩(wěn)定，組織分離常造成菌株的退化，目前生產(chǎn)上很少采用，只是進行野生菌株分離時，才比較常用。 （４）單孢子菌落接待：當孢子經(jīng)過 10 天的刺激培養(yǎng) , 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落 ,應及時用打孢子器把該菌落分離 ,每天都應觀察孢子萌發(fā)情況 , 如果不及時把菌落移接 ,該菌落會快速生長而影響較遲萌發(fā)單孢 子的分離。 ② 平板涂布 :將稀釋后的孢子懸浮液滴 ,用無菌的 T氏棒進行均勻涂布 ,每個平板含孢子大約 100 個 左右 。 （３）器械分離法：應用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至 PDA 平板中進行孢子刺激萌發(fā)培養(yǎng) ,獲得單孢純種。 ④ 培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊 PDA 培養(yǎng)基 (約 22 毫米方塊 ) 推貼至標記為單孢子的液滴 ,使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 ② 毛細滴管制備 :取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑 1 毫米的細管 , 稍冷卻后再加熱并迅速拉長 ,使管尖內(nèi)徑約 200 微米 ,剪斷即成毛細滴管 ,在滴管后端塞棉花 , 裝入消毒盒中后進行滅菌備用。 打孔器的外徑應小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須 檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。 ④ 孢子涂布：在無菌操作下，吸取 毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上 ,使用 T 氏棒把孢子均勻涂布在平板上 ,蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿 ,放置于 2425℃ 恒溫箱中培養(yǎng)。 ② 制孢子懸液：取一小塊收集有孢子的濾紙條，浸入 10 毫升無菌水試管中 , 搖振使孢子分散成懸液 ,用無菌 1 毫升移液管吸取 1 毫升孢子懸液于第 2 支試管中 , 搖振使其分期 ,再從第 2 支試管中吸取 1 毫升注入第 3 支試管中 , 如此反復稀釋直到孢子濃度達到 300500 個孢子 /毫升 ,備用。 ２、單孢分離 就是將采集到的孢子群單個分開進行培養(yǎng)，讓它單獨萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。 （２）涂布分離法：按無菌操作方法，取一小塊具有孢子的濾紙條，放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液，然后用已滅菌的試管，吸取孢子懸浮液，滴 12 滴到 PDA 試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動 試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。 （二）孢子分離 １、多孢分離法 即把多個孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長交錯在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個孢子間的種性互補，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性，此法比較簡易，在過去的蘑菇制種中應用較為普遍。把裝好子實體的孢子彈射收集器放在溫度為 1520℃ 的室內(nèi) ,經(jīng) 2448 小時左右， 可見到無菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。隨后用無菌刀切掉多余菌柄（約留下 即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準備好鋪有無菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖 所示）。一般 蘑菇種菇要求是第一潮菇，出菇較早，單生，個體健壯，特征典型的子實體，經(jīng)過仔細的觀察篩選后在菇床上做個記號，讓種菇充分生長，直至即將破膜時將菇采摘進行孢子彈射。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔孢子（是指其細胞核已經(jīng)地核配過程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個步驟，首先是采集孢子，其次進行單孢或多孢子分離。蘑菇菌種的分離方法有三種：即孢子分離、組織分離和基質(zhì)菌絲分離法 。細菌在培養(yǎng) 2428 小時后觀察， 霉菌在培養(yǎng) 72 小時后觀察 ,實驗組均不長任何菌落 ,視接種室、箱滅菌良好。不同的是將實驗的平皿均放置在 37℃ 下培養(yǎng) 24 小時 ,至多不超過 48 小時。實驗組少于１個菌落，視為滅菌合格。 （二）接種室（無菌室）、箱滅菌效果檢驗方法 １、平 皿法 先制作常任的霉菌培養(yǎng)基，如 CPDA、 PDA、 BSA 等，滅菌后，常規(guī)制作無菌平皿培養(yǎng)基（簡稱平板）。上述抽取的樣品，分別在無菌下取出少量培養(yǎng)基接入細菌培養(yǎng)基，然后在 37℃ 培養(yǎng) 24小時，檢查結果沒有細菌菌落產(chǎn)生，說明滅菌徹底。如檢查是否有細菌沒有殺死，必須使用細菌培養(yǎng)基進行檢測。2 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)57 天 ,如無霉菌、細菌、酵母等雜菌出現(xiàn)，則認為滅菌徹底。因此，除了要嚴格把好消毒、滅菌關外，同時還要嚴格執(zhí)行檢驗制度，兩者缺一不可。 表面活性劑的殺菌機理是改變細胞透性，使菌全破裂；聚集在菌體表面時，影響細胞代謝，破壞細胞蛋白與酶的活性。經(jīng)常使用新潔爾滅會使皮膚干裂，同時對粘膜有刺激性，對鋁制品有腐蝕性，對橡膠沒有消毒作用。一般可將原液 (5%)稀釋一倍，把器械或手、以及不能遇熱 的器具進行消毒。 市售的新潔爾滅是季胺鹽類的表面活性劑。 ８、表面活性劑 具有降低表面張力的物質(zhì)稱為表面活性劑。 在香菇生產(chǎn)中常用的硫酸銅也是防治真菌的良好消毒劑，使用濃度低于２％，噴灑物體表面，主要防治青霉類真菌。 1:5001:2020 的升汞溶液對多數(shù)細菌有勻菌作用。 ７、重金屬類 一些重金屬及其化合物，可使微生物的蛋白合成受破壞，亦可導致酶失活及取代細胞結構上的主要元素，使微生物生長受掏或?qū)е滤劳?。使用時將１克高效漂白粉溶于１升水中， 靜放１小時左右，取其上清液噴霧滅菌。高效漂白粉的有效氯含量為 4080%。 有機碘化物如碘福具有良好殺菌作用，有僅能殺死一般的細菌和真菌，并可使病毒滅活。 （２）碘及其化合物（絡合物） 37%碘溶于 7083%的乙醇中所配制的碘酊 , 是皮膚及小傷口的有效消毒劑。高錳酸鉀對霉菌殺傷效果很差。高錳酸鉀遇有機物時被還原成無殺菌作用的二氧化錳。 %的高錳酸鉀水溶液于５分鐘內(nèi)可殺死大多數(shù)細菌；５％水溶液于１小時內(nèi)可殺死細菌芽孢。亞硫酸及亞硫酸鹽等均為還原劑，能通過氧化還原反應起到殺菌作用。菌筒或菌磚上發(fā)現(xiàn)霉菌污染時，也可將生石灰直接撒到污染菌面上，殺菌效果良好。一般 13%石灰水就可起很好的殺菌作用。 使用生石灰時應加水，或生石灰遇到潮濕的物體，均會生成熟石灰，其化學反應式為：CaO+H2O→ Ca(OH)2+熱量。 ５、石灰與堿類 石灰分為生石灰 (CaO)與熟石灰 (Ca(OH)2)兩種。石碳酸水溶液濃度大時是致死因子；反之，則起抑菌作用。在 5%石碳酸水溶液中若加入 %的食鹽則可增加石碳酸藥效 ,如有乙醇存在時 , 則藥效大減。濃石碳酸能使皮膚變白、手指麻痹并可損壞皮膚與粘膜，對人畜有毒。乙醇能降低酚、甲醛等殺菌能力， 但能增強硫橫及升汞的殺菌效力。乙醇只會殺死細菌營養(yǎng)體，在香菇生產(chǎn)中，多用于接種時手的皮膚及器械殺菌。 如乙醇中加入稀酸或稀堿，殺菌效力增強。 7080%乙醇的殺菌能力較強。它們對微生物的毒害作用主要是迅速使細胞表面蛋白 質(zhì)、核酸及有關酶類被破壞。二氧化硫?qū)w維及金屬物品有腐蝕作用，因此，熏蒸房屋時應撤出易腐蝕物品。為提高滅菌效果，在熏蒸前，應先向空間及墻壁上噴少量水霧，有助于增加二氧化硫與生成亞硫酸，從而提高熏蒸滅菌效果。二氧化硫為無色氣體，有刺激味，滲透力強，易溶于水，生成亞硫酸，有助于提高滅菌率，同時可殺蟲、殺螨。銨鹽用量每立方米空間為 56 克。 有必要驅(qū)除室內(nèi)甲醛氣味時，可向室內(nèi)噴灑氨水，氨水濃度為 2528%, 噴的霧滴越小越好 ,噴氨水的量為熏蒸甲醛的一半 ,約 30分鐘左右 ,氨水與空氣中殘存甲醛結合 ,形成白色無臭粉末。具體做法是在坩鍋內(nèi)（或用培養(yǎng)皿），按每立方米體積加 10 毫升福爾馬林與 克高錳酸鉀的比例計量 ,任其甲醛揮發(fā) , 關好門窗悶一夜或更長時間 ,能夠達到良好的熏蒸滅菌目的。 加高錳酸鉀氧化劑熏蒸法，即甲醛是還原劑，故與氧化劑反應可產(chǎn)生大量熱。常用福爾馬林消毒空罐、無菌室或無菌箱等。并對真菌孢子及營養(yǎng)體均有極強的殺傷力 ,不受有機物 質(zhì)的影響。其反應式為：蛋白－氨基＋甲醛（氣體） → 蛋白－氨基、甲醛。 １、甲醛的殺菌機理是具有強還原作用。有的具有殺菌和抑菌作用，但加入培養(yǎng)基后阻礙了香菇菌絲體生長發(fā)育，也不能被采用。因此，化學藥品可超到殺菌作用或抑菌作用。 （二）化學滅菌方法 利用化學藥品滅菌或創(chuàng)造一個無菌環(huán)境，也是非常重要的滅菌手段。 ３、過濾除菌 是利用機械的阻留方法來除去介質(zhì)中的微生物。另外，紫外線照射微生物細胞后，在有氧的情況下，產(chǎn)生光化學氧化反應，生成過氧化氫 (H2O2),能發(fā)生強烈氧化作用， 引起細胞死亡而達到殺菌目的。 紫外線滅菌 紫外線是非電離輻射，波長 為 136400 納米，以波長 265266 納米的殺菌為最強。 ２、輻射滅菌 利用輻射產(chǎn)生的能量進行殺菌的方法，稱之輻射滅菌。由于干熱空氣穿透力 差，加之微生物蛋白質(zhì)在干燥條件下，不易凝固變質(zhì)，故干熱滅菌溫度，一般要求掌握在 160℃ ,維持 2 小時。干熱烤箱是干熱滅菌 的常用儀器，它是通過電熱絲進行加溫和調(diào)溫的，不僅可以用來滅菌，也可用于器皿等材料的烘干。耐熱的接種環(huán)、接種鏟、接種匙、接種針等，通過火焰灼燒，可徹底滅菌，試管口和玻璃瓶口，通過幾次火焰，溫度可達 200℃ 以上，一切微生物和芽孢，可全部殺死，達到無菌程度。干熱滅菌主要有兩種類型。 （２）干熱滅菌 采用灼燒或干熱空氣滅菌，稱為干熱滅菌。此方法運用于不耐高溫的 (100℃ 左右 )培養(yǎng)基的滅菌。缺點是滅菌時間長，能源消耗量大，稍不注意就有滅菌不徹底的現(xiàn)象發(fā)生。流通蒸汽的溫度一般為 100℃ 左右，要殺死耐熱性的芽胞， 必須延 長滅菌時間，一般為 68 小時。我國食用菌菌種生產(chǎn)過程中，有的利用蒸籠滅菌，有的利用鋼筋水泥砌成大型的