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2025-01-20 08:04本頁面
【正文】 等電點時也不易產(chǎn)生沉淀，所以單獨采用此方法分辨率較低，效果不理想。 63 應用 ? 在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點的特性來進行產(chǎn)品的分離純化。 ? 由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用 ，以提高沉淀能力和分離效果。 因此： 如需用等電點沉淀目的產(chǎn)物，則需要與鹽析法、有機溶劑沉淀法或者其他沉淀劑一起配合使用，來提高沉淀能力和分離效果。 64 由于一般蛋白質(zhì)等電點多在偏酸范圍內(nèi)，所以等電點操作中，一般加入鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸調(diào)節(jié) pH。 65 ?實例 ① 從豬胰臟中提取胰蛋白酶原： 胰蛋白酶原的 pI＝ ，可先于 pH 電點沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì) (pI=3． O)。 ② 工業(yè)生產(chǎn)胰島素 (pI＝ )時，先調(diào) pH至 性蛋白質(zhì)，再調(diào) pH至 (同時加入一定濃度的有機溶劑以提高沉淀效果 )。 66 ③ 堿性磷酸酯酶（ pI ）提?。? 發(fā)酵液調(diào) pH ，離心收集沉淀物。用 pH mol/L TrisHCl緩沖液重新溶解，加入 20～ 40%飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀 TrisHCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。 67 三、有機聚合物沉淀法 ? 定義 許多水溶性非離子型聚合物，特別是聚乙二醇(PEG)可用來進行選擇性沉淀用來純化蛋白質(zhì)。 常用的非離子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖 PEG：親水性強，溶于水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，分子量范圍較廣（聚合程度）。 68 ? PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒，不可燃性且對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護作用。 PEG沉淀法能在室溫下進行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。 ? PEG的分子量需大于 4000，最常用的是 6000和 20220。所用的PEG濃度通常為 20％，濃度再高，會使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。 PEG對后續(xù)分離步驟，影響較少，因此可以不必除去。但它的存在會干擾 Lowry法測定蛋白質(zhì)。 ? 原理 69 目前 PEG使蛋白沉淀的原理經(jīng)推測可能有以下幾個方面： 。 。 物，在重力作用下形成沉淀析出。 ，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。 但是上述推測都未得到證實。 70 ? 特點 優(yōu)點：操作條件溫和，不容易破壞蛋白質(zhì)活性；沉淀效能高，用很少的 PEG可以沉淀大量的生物大分子；沉淀后有機聚合物容易除去。 缺點：所得的沉淀中含有大量的 PEG ? 影響因素 71 蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量越大，在某一 PEG濃度下的溶解度越小。 蛋白質(zhì)濃度越高，其間相互作用越大，所需的PEG濃度越低，但是會導致分離效果不理想，所以溶液中蛋白濃度最好低于 10mg/mL。 pH越接近目的物等電點，沉淀所需 PEG濃度越低。 72 離子強度對部分蛋白的沉淀過程有影響。 在一定范圍內(nèi)（ 030℃ ），溫度對蛋白沉淀的影響不大。 73 其他沉淀技術 ：蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負電荷，能與金屬離子形成金屬復合鹽沉淀。常用的金屬離子 Zn2+ 、 Ca2+ 、 Pb2＋， 例如茶多酚的提?。豪貌瓒喾幽芘c Bi2+， Ca2+ ， Ag+等離子形成絡合沉淀的原理。 ：含氮有機酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。 ：磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復合鹽，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出 特點： 常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應用時必須謹慎。 74 沉淀技術的應用 蛋白質(zhì)（酶）的純化在粗分離階段常用到沉淀技術，以鹽析、有機溶劑沉淀、多聚物沉淀的應用最廣泛。 75 2. 核酸 ? 核酸的高電荷磷酸骨架（ 3）比蛋白質(zhì)，多糖等更具親水性 ? PEG應用于 DNA沉淀已普遍（ 磷酸緩沖液中 PEG濃度 10%） ? 酚、氯仿抽提后（變性蛋白質(zhì)），乙酸鈉中和磷酸骨架負電荷（降低其親水性，促聚集），乙醇可有效沉淀 DAN（有機溶劑沉淀） 76 多糖提取的初級階段多用到乙醇沉淀或乙醇分級沉淀，選擇性沉淀去除多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 思考： 沉淀技術包括哪些方法？它們的原理是怎樣的？ 77
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