沉淀技術(shù)教學(xué)課件ppt-資料下載頁(yè)
2025-01-20 08:04本頁(yè)面
【正文】 等電點(diǎn)時(shí)也不易產(chǎn)生沉淀，所以單獨(dú)采用此方法分辨率較低，效果不理想。 63 應(yīng)用 ? 在生化產(chǎn)品的分離純化過(guò)程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來(lái)進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。 ? 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用 ，以提高沉淀能力和分離效果。 因此： 如需用等電點(diǎn)沉淀目的產(chǎn)物，則需要與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或者其他沉淀劑一起配合使用，來(lái)提高沉淀能力和分離效果。 64 由于一般蛋白質(zhì)等電點(diǎn)多在偏酸范圍內(nèi)，所以等電點(diǎn)操作中，一般加入鹽酸、磷酸、硫酸等無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié) pH。 65 ?實(shí)例 ① 從豬胰臟中提取胰蛋白酶原： 胰蛋白酶原的 pI＝ ，可先于 pH 電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì) (pI=3． O)。 ② 工業(yè)生產(chǎn)胰島素 (pI＝ )時(shí)，先調(diào) pH至 性蛋白質(zhì)，再調(diào) pH至 (同時(shí)加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果 )。 66 ③ 堿性磷酸酯酶（ pI ）提?。? 發(fā)酵液調(diào) pH ，離心收集沉淀物。用 pH mol/L TrisHCl緩沖液重新溶解，加入 20～ 40%飽和度的硫酸銨分級(jí)，離心收集的沉淀 TrisHCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。 67 三、有機(jī)聚合物沉淀法 ? 定義 許多水溶性非離子型聚合物，特別是聚乙二醇(PEG)可用來(lái)進(jìn)行選擇性沉淀用來(lái)純化蛋白質(zhì)。 常用的非離子型多聚物：不同分子量的聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖 PEG：親水性強(qiáng)，溶于水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，分子量范圍較廣（聚合程度）。 68 ? PEG是一種特別有用的沉淀劑，因?yàn)闊o(wú)毒，不可燃性且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。 PEG沉淀法能在室溫下進(jìn)行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。 ? PEG的分子量需大于 4000，最常用的是 6000和 20220。所用的PEG濃度通常為 20％，濃度再高，會(huì)使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。 PEG對(duì)后續(xù)分離步驟，影響較少，因此可以不必除去。但它的存在會(huì)干擾 Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)。 ? 原理 69 目前 PEG使蛋白沉淀的原理經(jīng)推測(cè)可能有以下幾個(gè)方面： 。 。 物，在重力作用下形成沉淀析出。 ，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。 但是上述推測(cè)都未得到證實(shí)。 70 ? 特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，不容易破壞蛋白質(zhì)活性；沉淀效能高，用很少的 PEG可以沉淀大量的生物大分子；沉淀后有機(jī)聚合物容易除去。 缺點(diǎn)：所得的沉淀中含有大量的 PEG ? 影響因素 71 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量越大，在某一 PEG濃度下的溶解度越小。 蛋白質(zhì)濃度越高，其間相互作用越大，所需的PEG濃度越低，但是會(huì)導(dǎo)致分離效果不理想，所以溶液中蛋白濃度最好低于 10mg/mL。 pH越接近目的物等電點(diǎn)，沉淀所需 PEG濃度越低。 72 離子強(qiáng)度對(duì)部分蛋白的沉淀過(guò)程有影響。 在一定范圍內(nèi)（ 030℃ ），溫度對(duì)蛋白沉淀的影響不大。 73 其他沉淀技術(shù) ：蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)電荷，能與金屬離子形成金屬?gòu)?fù)合鹽沉淀。常用的金屬離子 Zn2+ 、 Ca2+ 、 Pb2＋， 例如茶多酚的提取：利用茶多酚能與 Bi2+， Ca2+ ， Ag+等離子形成絡(luò)合沉淀的原理。 ：含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。 ：磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽(yáng)離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出 特點(diǎn)： 常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。 74 沉淀技術(shù)的應(yīng)用 蛋白質(zhì)（酶）的純化在粗分離階段常用到沉淀技術(shù)，以鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、多聚物沉淀的應(yīng)用最廣泛。 75 2. 核酸 ? 核酸的高電荷磷酸骨架（ 3）比蛋白質(zhì)，多糖等更具親水性 ? PEG應(yīng)用于 DNA沉淀已普遍（ 磷酸緩沖液中 PEG濃度 10%） ? 酚、氯仿抽提后（變性蛋白質(zhì)），乙酸鈉中和磷酸骨架負(fù)電荷（降低其親水性，促聚集），乙醇可有效沉淀 DAN（有機(jī)溶劑沉淀） 76 多糖提取的初級(jí)階段多用到乙醇沉淀或乙醇分級(jí)沉淀，選擇性沉淀去除多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 思考： 沉淀技術(shù)包括哪些方法？它們的原理是怎樣的？ 77
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