沉淀技術(shù)教學(xué)課件ppt-文庫(kù)吧資料
2025-01-26 08:04本頁(yè)面
【正文】 5 ~20mg/mL）為好，多糖則以 1～ 2％起始較合適。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高（ P33 圖 39）。 ? 100指加入有機(jī)溶劑的濃度為 100%，若加入的有機(jī)溶劑濃度為 95%，則上式中 100應(yīng)換為 95。 由于甲醇、丙酮對(duì)人體有一定的毒性，限制了有機(jī)溶劑法的適用范圍，所以不如鹽析法使用普遍。 45 46 使用較多的有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇、丙酮。 較靜電作用占更主要的地位。 原理 介電常數(shù) 表征的是電介質(zhì)的束縛電荷的能力，極性越大，介電常數(shù)越大。 透析 over 41 42 第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一， 常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等 定義： 向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。 原理：大分子不能透過(guò)半透膜，小分子例如無(wú)機(jī)鹽、單糖，可以透過(guò)膜擴(kuò)散到水或緩沖液中。 40 鹽析后處理工作 —— 脫鹽 由于鹽析沉淀產(chǎn)物中含鹽量較高，所以通過(guò)鹽析法得到蛋白質(zhì)后需要經(jīng)過(guò)脫鹽處理。 39 （ 3） 離心或過(guò)濾，收集 沉淀物 ?對(duì)于高濃度的硫酸銨溶液一般采用過(guò)濾的方法，因?yàn)殡x心要較高的轉(zhuǎn)速的時(shí)間。 （ 2）沉淀物的陳化 38 高分子溶液在防止過(guò)程中自發(fā)的聚集而沉淀的現(xiàn)象稱為 陳化現(xiàn)象 。 37 3） . 透析平衡法 將要鹽析的樣品臵于透析袋中，浸入飽和硫酸銨溶液中透析，透析袋中硫酸銨飽和度逐步提高，達(dá)到一定飽和度后，目的蛋白質(zhì)析出，停止透析。 適用范圍： 適用于飽和度不高，原來(lái)溶液體積不大的情況，如果加入飽和溶液后，體積過(guò)大，應(yīng)改用固體加入法為好。 取過(guò)量硫酸銨加熱溶解，在 0℃ 或室溫放置，直至固體析出，得到飽和溶液，飽和度調(diào)整計(jì)算公式 V=V0 (S2— S1)/(1— S2) V為應(yīng)加入飽和硫酸銨溶液的體積， V0 是蛋白質(zhì)溶液的原始體積， S2是所要達(dá)到的硫酸銨飽和度， S1 原來(lái)溶液的硫酸銨飽和度。 特定溫度下，各種不同飽和度應(yīng)加入的硫酸銨的量可以從下表查出。 1）加入沉淀劑 優(yōu)級(jí)純 ≥ % 分析純 ≥ % 化學(xué)純 ≥ % 33 加鹽的方法 （ 1） .固體硫酸銨加入法 （需要量大時(shí)）。 32 ? 硫酸銨 鹽使用前處理 重金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，硫酸銨中常含有少量重金屬離子，所以要進(jìn)行預(yù)處理。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在 0℃ ～ 4℃ 下操作，以避免活力喪失。 ? 在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。 28 29 pH值對(duì)鹽析的影響 在等電點(diǎn)處溶解度小， pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，提高鹽析效率。 2) 低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。 2）離子種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度也有一定的影響，通常離子半徑小而帶高電荷的離子的影響較強(qiáng)，半徑大而帶低電荷的離子影響較弱。 26 27 鹽析的影響因素 鹽飽和度和離子類型 1）不同的蛋白質(zhì)鹽析，要求的鹽飽和度不同。 2. 次常用 Na2SO4。有的酶或蛋白質(zhì)用 2～ 3mol/L濃度的（ NH4） 2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。 由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（ 0～ 4℃ ）進(jìn)行。（ P26 表 31 ） 22 （ 4）鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離 過(guò)高的鹽溶液密度能夠干擾蛋白質(zhì)的沉降和沉淀物的收集，并且沉淀下來(lái)的目的產(chǎn)物中可能混有大量的鹽，不利于目的產(chǎn)物的回收。 （ 1）相同離子濃度條件下，不同種類鹽對(duì)同一種蛋白質(zhì)的鹽析效果不同； 例：不同種類鹽對(duì)一氧化碳血紅蛋白影響不同（ p26 圖 34） 所以選用鹽的時(shí)候要考慮的不同鹽的鹽析效果，常見陰離子的鹽析效果： PO43 SO42 CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN – 常見陰離子的鹽析效果： NH4+K+Na+Mg+ 20 （ 2）高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液； 離子強(qiáng)度的升高，可以降低加速鹽析的過(guò)程，所以要求鹽析用鹽能夠配制高離子強(qiáng)度的鹽溶液。 4. β分段鹽析用于蛋白質(zhì)進(jìn)一步的精細(xì)分離純化。 2. β鹽析 ：在一定的離子強(qiáng)度下（ I ） ，改變?nèi)芤旱?pH、 T ，達(dá)到沉淀的目。 鹽濃度 ↑→ 離子強(qiáng)度 I↑→S↓→ 析出。 14 15 鹽析公式
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