【正文】 莧作為一種食品和藥用植物被使用了數千年，它含有豐富的營養(yǎng)與蛋白質、碳水化合物、Ca, K, Zn, and Na (Aberoumand 2008)。作為一種中藥，馬齒莧是很重要的，因為其特殊的醫(yī)療功能，傳統(tǒng)上它一直被用作用于治療痢疾和血便和外部為起泡、潰瘍、濕疹、丹毒、昆蟲和蛇咬傷(Chen et al. 2003。 Zhang et al. 2002。 Yazici et al. 2007。 Palaniswamya et al. 2004)。在中藥材的許多有效成分中，黃酮類化合物是其中一種最受關注的化合物。黃酮類化合物有獲得了高度的關注，因為其含量豐富，具有降低血脂、抗氧化、降低膽固醇、抑制血栓、擴張冠狀動脈等功效(Deng et al. 2008。 De Souza et al. 2008。 Su et al. 2008。 Shao et al. 2007。 Volpi and Bergonzini 2006。 Zhang et al. 2007。 Keith et al. 2007)。最近，黃酮類化合物在醫(yī)學的發(fā)展和食品領域成為一個非常熱門的研究方向。在馬齒莧中，黃酮和多糖是含量最豐富的有效成分。據報道，在馬齒莧中發(fā)現了7種黃酮類化合物，包括：槲皮素、山奈酚、木犀草素、楊梅酮、木犀草素、染料木黃酮(Chen et al. 2003。 Zhang et al. 2007)。在醫(yī)學和食品工業(yè)上，提取和分離具有高生物活性、高含量的黃酮類化合物是至關重要。因此，研究提取和測定技術的黃酮類化合物是很有意義的。傳統(tǒng)上，馬齒莧中黃酮的提取通常應用鹵制提取和回流提取。作為一個新興的提取方法，超聲提取法已經被用作提取黃酮類化合物。(Jin et al. 2008。 Chen et al. 2008a)。不幸的是，應用這種方法，黃酮不能被充分的提取，是由于提取的雜質很多，提取時間長，這些因素限制這種提取方法。因此，這需要去發(fā)展更有效的和可靠的提取方法。微波萃取似乎有希望達到目的。微波萃取的優(yōu)勢是具有強烈的滲透性的力量，高選擇性、高加熱能力，更少的有機溶劑用量、較短的提取時間、高提取率(Ganzler et al. 1990)，作為一種新的提取工藝，它適合提取熱敏感物質和天然活性成分(Chen et al. 2008b)。本文中應用壓力自控系統(tǒng)微波分解方法提取黃酮類化合物。系統(tǒng)的溫度能被控制在一定范圍內，因此，能夠避免熱分解。在目前的研究中，微波萃取法，這種簡單、有效的方法已被發(fā)展出來，與此同時，微波萃取法優(yōu)勢顯示了出來。根據報道，黃酮類化合物有多種檢測方法，包括：薄層色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳和分光光度法。在這些方法中，只有分光光度法能測定總黃酮的總量。紫外—可見分光光度法是應用最廣泛測定黃酮含量的方法。在這種方法中，直接測量和顯色法是常用的方法。但是顯色法比直接測量個好，因為顯色法不會被其它成分影響，如多糖和皂苷。在研究中，介紹一種簡單顯色方法。應用紫外—可見分光光度法，以NaNO2–Al(NO3)3–NaOH顯色來測定馬齒莧中黃酮類化合物的含量。材料和方法采集的樣本為了研究馬齒莧中黃酮含量，采集不同月份的三種馬齒莧作為實驗材料。三個樣品中兩種是作為中藥材從中國中醫(yī)藥有限公司購買(湖南,中國)。中醫(yī)的樣品被收集于2007年8月,另一種中藥樣品被收集是在2007年7月。我們也在2008年6月，從湖南長沙郊區(qū)(中國)收集了三個樣品的野生馬齒莧。樣品制備新鮮的樣品用水清洗,一些樣分為根、莖、葉進行研究。所有的樣品壓碎磨成粉末，然后在50℃干燥，干燥后粉末樣本的放置在干燥皿中。藥品和儀器：標準物質蘆丁(97%)購買至國藥化學試劑的有限公司(中國)。所有的試劑和藥品均為分析純。整個研究過程中要使用蒸餾水。：微波分解系統(tǒng)(MDS2002AT、上海、中國)，AS2060B超聲波清潔器(中國天津)，提取時使用索氏提取器(250mL、長沙、中國)。高速離心機(TGL16C、上海、中國)，其是在相分離中使用的。多功能植物粉碎機(FW100、北京、中國)，用于樣品分碎。旋轉蒸發(fā)器(RE52CS、上海、中國)，被用來濃縮提取液。紫外—可見分光光度計JASCO V530(日本)，用于檢測含量。黃酮類化合物的提取提取之前，馬齒莧用多功能植物粉碎機進行粉碎。應用索氏提取器，以石油醚為溶解進行脫脂，直到顏色消失。馬齒莧中黃酮提取的五種方法如下：，至于錐形瓶中，加入25mL70%乙醇，密封后至于微波分解系統(tǒng)中提取。提取溫度為50℃。微波提取后，提取液在11000rpm下離心分離30min。上層清夜至于25mL容量瓶中，用70%乙醇標定。，至于錐形瓶中，加入25mL70%乙醇，密封后至于超聲波清潔器，在室溫25℃。然后按照上述所作 (按照對微波萃取的描述)。，至于錐形瓶中，加入25mL70%乙醇，裝上回流提取裝置，然后按照上述所作 (按照對微波萃取的描述)。，至于索氏提取器中，加入80mL70%乙醇，濃縮提取液，然后按照上述所作 (按照對微波萃取的描述)。，至于錐形瓶中，加入25mL70%乙醇，然后在室溫25℃提取48h，然后按照上述所作 (按照對微波萃取的描述)。黃酮含量檢測首先，取2mL提取液至于10mL容量瓶中，加入5%，搖勻，放置6min后加入10%Al(N03)，搖勻，放置6min后加入4%，再用30%乙醇定容，搖勻，以30%乙醇為空白參比，l5min后用lcm比色皿于500nm測定吸光度。標準液的配制蘆丁標準溶液()配制如下: 準確地稱量蘆丁(200mg)溶解在70%乙醇中，然后以70%乙醇標定在100mL容量中。取2mL溶液然后以70%乙醇標定在25mL容量中。標準曲線的繪制準確地量取蘆丁標準液(、分別至于六個容量瓶(10毫升)，然后按照上述所作 (按照對黃酮含量檢測的描述)。以蘆丁標準液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，做線形圖。圖1所示為標準曲線圖,回歸方程為：A=?+ (r=).Fig. 1 Standard curveFig. 2 The color reaction of flavonoids and chromogenic system結果和討論黃酮的顯色反應和顯色機理黃酮的結構如圖2a所示，馬齒莧中黃酮類大部分為3,4二羥基取代物(如圖2b所示)，擁有3,4二羥基取代物的黃酮的黃酮會與NaNO2Al(NO3)3NaOH體系發(fā)生顯色反應。黃酮的顯色反應和發(fā)色系統(tǒng)在圖2c所示結構中。如圖2c所示，這反應的基礎是鉬離子形成堿性螯合物。通過側量這些紅色螯合物的吸光度，來確定黃酮類化合物的含量。圖3 試樣與蘆丁的紫外光譜波長的選擇應用紫外掃描(圖3所示)確定吸收波長。配制試樣和蘆丁的標準液(按照黃酮標準液的方法)。從圖3可知，在可見光范圍可以看到那蘆丁和試樣最大吸收波長為500nm，所以500nm的波長是可以選擇的檢測目標分析物。對比不同提取劑提取效率應用微波提取法，研究三種不同的提取劑提取效率，包括：甲醇水、乙醇水、丙酮水。對比它們的提取效率，結果如圖4所示。從圖4中，我們看出提取效率最高的是乙醇。圖4 溶劑對提取效果的影響提取方法的選擇研究五種不同的提取方法，包括：微波提取、索氏提取法、浸制提取法、回流提取法、超聲波萃取，試樣中黃酮含量通過紫外可見分光光度計檢測。結果如表1所示。表1不同提取方法的比較(n = 5)從表1中，我們可以看出微波提取法提取效率最高，與所示提取法相比，微波提取法的提取時間縮短了97%，與回流提取法相比縮短了94%。微波萃取是一種快速、高效、經濟的方法提取馬齒莧中黃酮類化合物的方法，不同與傳統(tǒng)的加熱提取法，微波同時加熱整個樣品，因為微波射線是很有穿透力。微波射線穿過萃取介質，并達到了內在的維管束和植物細胞組織。結果是材料內部溫度迅速上升，內部壓力超過細胞壁擴展限度，因此細胞壁破裂和細胞內物質可以自由地流出來，進入提取溶劑中。因此，微波萃取提取效率最高，這是最適合提取馬齒莧中黃酮類化合物的方法。微波萃取條件的優(yōu)化很多因數影響馬齒莧中黃酮的影響提取效率。通過單因素實驗，找出每個因數最合適的水平。然而，由于影響因素之間的相互作用的，最優(yōu)水平中的各個因素可能不是最優(yōu)提取條件。正交試驗是一種科學的安排多因素的方法，以單因素實驗為基礎，通過正交試驗最佳提取條件可以算出了。在本文中，微波提取最佳提取條件是通過單因素試驗和正交試驗制定。影響提取率因素很多，其中提取溶劑、液固比、微波輻射時間、萃取溫度是最主要的影響因素。單因素實驗中，采取一因素改變其他因素不變方式。(a).提取劑的選取研究三種不同的提取劑，保持微波輻射條件一致，其他條件(料液比為1:提取溫度為35℃、提取時間問5min)。如圖4所示，乙醇提取溶劑的濃度70%(v / v)的時候吸光率最高，所以為在接下來的實驗選用70%(v / v)的乙醇。(b).料液比的選取通過使用1:10 (g/mL)、1:11:1:1:1:50，保持微波輻射條件一致，其他條件(乙醇濃度70%(v / v)、提取溫度為35℃、提取時間問5min)。如圖5所示，當料液比由1:15到1:40時，提取效率增大，料液比由1:40增大到1:50時，提取率增加趨勢緩。因此，在接下來的實驗中選擇料液比1:40。(c).提取時間的選取微波輻射時間選取10 min，保持微波輻射條件一致，其他條件(乙醇濃度70%(v / v)、料液比1:提取溫度35℃)。如圖5所示，當輻射時間由4到8min時，提取效率增大，料液比由8增大到10min時，提取率增加趨勢緩。因此，在接下來的實驗中選擇輻射時間8min。(d).提取時間的選取微波提取條件選定乙醇濃度70%、料液比1:微波輻射時間8min，提取溫度隨不同層次(3450、55℃)進行研究分析。如圖5所示，提取效率最高的時候是45℃。然而，當溫度更高，提取效率降低。其可能是馬齒莧中含有熱敏感成分，溫度高時，發(fā)生分解反應。因此，在接下來的實驗中選擇提取溫度45℃。圖5 提取條件對微波提取法的影響優(yōu)化微波提取條件，選用四因素三水平的正交實驗。正交表和其結果如表表3所示。表2 正交因數水平表3 L9(34)正交結果K和R值,計算結果都列在表3中，K值表示不同水平的各個因素提取效率平均值，R值表示K值的變化方差。方差分析結果表明乙醇濃度是最大的影響因數，接下來是提取溫度、輻射時間、料液比。在因數A中，K2最大表示與其它水平相比，K2的提取效率最高，是最佳提取水平?；谕瑯拥脑瓌t，選擇BCD3。換句話說，最高產量為下列條件:乙醇濃度70%、料液比1:50、微波輻射時間9min、提取溫度50℃。為了驗證最佳提取工藝條件，在最佳提取條件下進行一組實驗，其結果提取率高于任何一組實驗(吸光度=,n=5)。提取率研究，微波提取后進行紫外光譜掃描，其結果見表4。我們可以看出，應用微波提取法和紫外可見分光光度計檢測時，% (RSD=%)，表明其是最合適的提取方法。表4 提取率研究結果方法研究儀器裝置的精密度測試通過分析檢測一個試樣的十次實驗，檢察紫外光譜來評估儀器的精密度。%，儀器的精密度符合要求。重復分析法對重復性的的評估，通過做五組的微波提取實驗。%，重復性符合要求。提取方案的穩(wěn)定性通過每15min檢測一次的方法，評估提取方案的穩(wěn)定性。%，表明在2h內提取方案有出色的穩(wěn)定性。試樣的分析應用微波提取法提取不同種類馬齒莧中的黃酮，并通過紫外可見分光光度計檢測其含量，其結果見表5。表5 不同試樣中黃酮類化合物的分析結果從表5中推斷出，不同批次的馬齒莧中黃酮的提取效率是不同的，不同的部分(根、莖、葉)中，根中黃酮含量最豐富，接下來是莖和葉。比較經過脫脂想、處理和未處理的馬齒莧中黃酮好的含量(見表5)。從表5中可以看出油脂類物質對檢測有影響，所以研究之前，試樣必須經過脫脂處理。結論在本文的研究中，微波輔助提取法作為提取方法，檢測方法應用紫外可見分光光度計。%，比其他方法更高，也是最適合提取馬齒莧中黃酮類化合物的方法，選用的檢測方法是方便、快速、可靠和有用的。馬齒莧中有效成功十分復雜和多樣，然而，據我們所知，沒有特殊的成分曾經已被報道過。黃酮類化合物是去主要的有效成分，又有許特殊的醫(yī)療和保健功效。因此，在我們工作中快速、有效地進行提取，有非常深遠的意義。附 錄B 英文原文參 考 文 獻 45