【正文】 ? (1) 供試品熱原檢查合格 初試 3只家兔中，升溫均小于 ℃ ，總升溫?cái)?shù)小于 ℃ ； ? 或復(fù)試 5只家兔中，體溫升高大于或等于 ℃ 者不超過(guò) 1只，且初試、復(fù)試 8只家兔的升溫總數(shù)小于或等于 ℃ 時(shí)，均可判斷供試品熱原檢查合格。 ? (2) 供試品熱原檢查不合格 初試 3只中，體溫升高大于或等于 ℃ 超過(guò) 1只，或復(fù) ? 試的 5只中，升溫大于或等于 ℃ 的家兔超過(guò) 1只，或初試、復(fù)試 8只家兔的升溫總數(shù)大于 ℃ 時(shí)，均判斷供試品熱原檢查不合格。當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以 0℃ 計(jì)。 6．原始記錄 ? （詳見(jiàn)附錄六、附錄七）。 生物檢定技術(shù) ?第四節(jié) 降壓物質(zhì)檢查 ? 本法系比較組胺對(duì)照品與供試品引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。 l．儀器與用具 ? 自動(dòng)平衡記錄儀、分析天平 (十萬(wàn)分之一 )、電冰箱、直形剪刀、彎形剪刀、止血鉗、鑷子、眼科直形小鑷子、彎頭小鑷子、彎頭小剪刀、手術(shù)縫合針、注射器 (1mL， 2mL，5mL， 10mL)、注射針頭 (5號(hào)， 9號(hào) )、 A類(lèi)吸量管 (1mL， 2mL， 10mL)、具塞試管 (25mL， 50mL)、燒杯 (100mL)、雙向活塞管、量杯 (100mL)、脫脂棉、紗布、線繩、乳膠管、動(dòng)靜脈插管、手術(shù)縫合線等。 2．試劑 ? 垂體后葉標(biāo)準(zhǔn)品、 10%戊巴比妥鈉溶液 (臨用時(shí)用注射用水新鮮配制 )、注射用水、氯化鈉注射液、烏拉坦溶液、肝素鈉 (12 500U/2mL)、 品溶液 (臨用時(shí)新鮮配制 )。 3．試驗(yàn)動(dòng)物 ? 降壓物質(zhì)檢查用貓應(yīng)毛色光滑，眼睛有神，無(wú)病癥，鼻孔無(wú)黏液，肛門(mén)清潔干燥，皮下無(wú)腫塊，動(dòng)作敏捷，體重 ，雌雄均可，雌貓無(wú)孕。 4．檢定用溶液 ? (1) 組胺對(duì)照品溶液的配制 用十萬(wàn)分之一天平精密稱(chēng)取磷酸組胺對(duì)照品 25mg左右，按組胺計(jì)算加注射用水溶解使成每 1mL中含 ，分裝于小瓶中， 4～ 8℃ 避光貯存，如無(wú)沉淀析出，可在 3個(gè)月內(nèi)使用。臨用前，用氧化鈉注射液稀釋成 。 ? (2) 降壓物質(zhì)供試品溶液的配制 按各藥品標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定的劑量，用氯化鈉注射液配 ? 成適當(dāng)濃度的供試品溶液。如供試品為原料藥，則精密稱(chēng)定適量，按效價(jià)或含量計(jì)算加水量。如供試品為制劑，按標(biāo)示量計(jì)算加水量，稀釋至適當(dāng)濃度。 5．降壓物質(zhì)檢查法 ? (1) 手術(shù)前的準(zhǔn)備 將靜脈插管用乳膠管與灌滿(mǎn)氯化鈉注射液的雙向活塞裝置連接 ? 好，并排除氣泡；將動(dòng)脈插管用三通與灌有 1/2氯化鈉注射液的制壓瓶和信號(hào)轉(zhuǎn)換裝置連接好，排除氣泡；制壓瓶保持一定壓力；準(zhǔn)備好自動(dòng)平衡記錄儀 (或多導(dǎo)生理儀 )；接通電源開(kāi)啟記錄儀，檢查運(yùn)行是否正常。 ? (2) 貓的麻醉 把貓放入布袋內(nèi)稱(chēng)重，按體重計(jì)算麻醉劑 (戊巴比妥鈉 )劑量 (40～ 45mg/kg)， ? 用 10%戊巴比妥鈉溶液按 1mL/kg進(jìn)行腹腔注射，將麻醉好的貓，仰臥于保溫手術(shù)臺(tái)上并固定好。 5．降壓物質(zhì)檢查法 ? (3) 動(dòng)脈、靜脈的分離與插管 ? ① 股靜脈的分離與插管 用彎形剪刀剪干凈手術(shù)部位的毛，用鑷子將近膝部、股內(nèi)側(cè)的皮膚剪開(kāi)，分離出一側(cè)股靜脈，剪一小口，插入靜脈插管、扎緊并固定于貓腿上。推入一定量的氯化鈉注射液，如其暢通無(wú)漏水即可。 ? ② 動(dòng)脈的分離與插管 用手術(shù)彎形剪刀剪去頸部毛，再用鑷子將咽部皮膚提起，用剪刀沿中線自甲狀軟骨下方剪至胸骨上緣，在胸鎖乳突肌與頸闊肌之間分離出一側(cè)頸動(dòng)脈后，再把與動(dòng)脈相連的神經(jīng)分開(kāi)，剪口插入動(dòng)脈管，扎緊并固定好，將動(dòng)脈插管與記錄儀之間的螺旋夾打開(kāi)，打開(kāi)記錄儀觀察走紙，檢查結(jié)扎是否嚴(yán)密，走紙不下滑即可。 ? ③ 血壓記錄 往動(dòng)脈插管注入 ～ ，緩慢打開(kāi)動(dòng)脈夾，記錄血壓。 5．降壓物質(zhì)檢查法 ? (4) 供試品的檢查 ? ① 靈敏度測(cè)定 打開(kāi)動(dòng)脈夾后，觀察貓的血壓。待血壓穩(wěn)定后，從股靜脈注入第一組組胺對(duì)照品，分別按每千克體重 ， ，每次注入后均以 5～ 6mL氯化鈉注射液送入。相鄰兩針間隔應(yīng)一致 (不少于 3～ 5min)，并應(yīng)在前一針?lè)磻?yīng)恢復(fù)后再進(jìn)行下一針注射。如此重復(fù) 2～ 3組。如果 ，同時(shí)相應(yīng)各劑量所致反應(yīng)的平均值有差別，則認(rèn)為該貓的靈敏度符合規(guī)定。 ? ② 供試品溶液測(cè)定 待貓的血壓恢復(fù)穩(wěn)定后，開(kāi)始供試品的測(cè)定，依次注射組胺對(duì)照品 (ds) (dΤ)(調(diào)節(jié)兩者溶液的濃度，使注入的體積一致 )。 4針的順序?yàn)?ds、 dΤ， dΤ、 ds。然后以第一針與第三針、第二針與第四針?biāo)碌姆磻?yīng)分別比較。 ? 如 dΤ所致反應(yīng)均小于 ds所致反應(yīng)值的一半，則判為供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定；如果 dΤ所致的反應(yīng)超過(guò) ds所致反應(yīng)的一半，則按上述順序再注射4針，并按相同方法分別比較。如 dΤ所致反應(yīng)均不大于 ds所致反應(yīng)值，則仍判為供試品的降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定；如果 dΤ所致反應(yīng)值均大于 ds所致反應(yīng)值，則判為供試品的降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。否則，應(yīng)另取一只貓復(fù)試。如復(fù)試結(jié)果仍有 dΤ所致反應(yīng)值大于 ds所致反應(yīng)值，即判為供試品降壓物質(zhì)檢查不符合規(guī)定。 ? （詳見(jiàn)附錄八）。 生物檢定技術(shù) ?第五節(jié) 異常毒性檢查 一、定義 ? 本法系將一定劑量的供試品溶液注入小鼠體內(nèi)或口服給藥，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察小鼠出現(xiàn)死亡的情況，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法。 ? 1．儀器與用具 ? 壓力蒸汽滅菌器、天平、小鼠固定器和支架、注射器、大稱(chēng)量瓶、吸量管、移液管、小燒杯、胃管灌注針頭。 ? 2．試劑 ? 75%乙醇、注射用水、氯化鈉注射液或其他的溶劑。 ? 3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ? 采用昆明種小白鼠，須健康無(wú)傷，毛色光滑，眼睛紅亮，活潑，體重 17～ 20g。其來(lái)源、飼養(yǎng)條件、品種、性別均應(yīng)相同。雌鼠不得有孕。復(fù)試時(shí)用 18～ 19g小白鼠。 ? 試驗(yàn)動(dòng)物在稱(chēng)重前，自然飽腹。 ? (1) 原料藥 精密稱(chēng)取適量，置適宜容器中，按規(guī)定濃度加精密量取的一定量溶劑，攪拌使溶解。 ? (2) 注射液的稀釋 用 75%乙醇棉球消毒安瓿頸部，精密量取一定量藥液，按規(guī)定濃度，加精密量取的一定量溶劑，混勻。 ? 除另有規(guī)定外，一般用氯化鈉注射液作為溶劑制成供試品溶液，供試液制備后，應(yīng)立即使用，最長(zhǎng)不得超過(guò) 24h。 ? 除另有規(guī)定外，取小鼠 5只，按該藥品項(xiàng)下規(guī)定的給藥途徑，每只小鼠給予供試液 ，給藥途徑分為以下幾種。 ? (1) 靜脈注射 將小鼠放入固定器中，使尾巴暴露在外，用 75%乙醇擦拭鼠尾注射部位。尾靜脈注入供試品溶液，注射速度 4～ 5s，如注射部位發(fā)白且推入藥品時(shí)有阻力，表示針頭未插入靜脈內(nèi)，應(yīng)重插。如藥液有損失，應(yīng)另取小鼠注射。注射完畢后，拔出針頭，在注射部位止血后，取出小鼠，放鼠盒中，觀察即時(shí)反應(yīng)，并作記錄。規(guī)定緩慢注射的品種可延長(zhǎng)至 30s。 ? (2) 腹腔注射 一手握小鼠 ， 用拇指和食指捏住小鼠頸背部 ， 用無(wú)名指及小指固定其后肢及尾腹部向上 。 用 75%的乙醇擦拭小鼠腹部注射部位 。 針頭由小白鼠腹部左側(cè)皮下注入 ， 并使針頭在皮下平行通過(guò)腹部中線后 ，進(jìn)入右側(cè)腹腔部位 ， 切勿使針頭向上 ， 以防針頭刺傷內(nèi)臟而死亡 。 腹腔注人供試品溶液 ，注射完畢后 ， 拔出針頭 ， 放鼠盒中 ， 觀察即時(shí)反應(yīng) ， 并作記錄 。 ? (3) 皮下注射 握小鼠 ， 同腹腔注射法 ， 用75%乙醇擦拭小鼠腹部注射部位 。 于腹部左側(cè)皮下刺入 ， 并使針頭在皮下平行通過(guò)腹部中線后 ， 皮下注入供試品溶液 ， 可見(jiàn)注射部位皮下出現(xiàn)白色泡狀隆起 。 注射完畢后 ，拔出針頭 ， 放鼠盒中 ， 觀察即時(shí)反應(yīng) ， 并作記錄 。 ? (4) 口服給藥 握小鼠，同腹腔注射法，注射器接上胃管灌注針頭，緩緩插入小鼠口腔，使其順利進(jìn)入食道，緩慢注入供試品溶液，如進(jìn)針遇到阻力，應(yīng)退出重插，不能強(qiáng)行插入，以免刺破食管或誤入氣管，使動(dòng)物死亡。給藥完畢后，拔出針頭，放鼠盒中，觀察即時(shí)反應(yīng)，并作記錄。 ? 注射完畢后，除觀察小鼠的即時(shí)反應(yīng)，應(yīng)在 4h，24h， 48h觀察和記錄動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡數(shù)量。 ? (1) 鼠盒內(nèi)小鼠數(shù)量不宜過(guò)多，以避免發(fā)熱出汗影響試驗(yàn)結(jié)果。 ? (2) 實(shí)驗(yàn)室與飼養(yǎng)室溫度應(yīng)控制在 19～28℃ ，過(guò)高或過(guò)低均可影響試驗(yàn)結(jié)果。 ? (3) 試驗(yàn)操作粗暴會(huì)導(dǎo)致小鼠應(yīng)激和異常反應(yīng)，給試驗(yàn)帶來(lái)不良影響。 7．結(jié)果判斷 ? 《 中國(guó)藥典 》 (2022年版 ) 規(guī)定：除另有規(guī)定外，全部小鼠在給藥后 48h內(nèi)不得死亡；如有死亡時(shí)，應(yīng)另取 10只體重 18～ 19g的小鼠復(fù)試，全部小鼠在 48h內(nèi)不得死亡。給藥后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不引起可能死亡的任何反應(yīng)不屬于異常毒性檢查范圍，不作為判斷結(jié)果的依據(jù)。 8．原始記錄 ? （詳見(jiàn)附錄九）。