【正文】 分子標(biāo)記物，篩選出存在于糖尿病病人呼吸氣體中代謝相關(guān)分子標(biāo)記；為將 GLP1用于糖尿病心血管病并發(fā)癥的防治提供基礎(chǔ)和臨床研究資料。 主要研究內(nèi)容： 1. 大血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生中的代謝和氧化應(yīng)激的特征譜研究：以正常大鼠和糖尿病模型大鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞為研究對象，采用代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)研究方法，研究其在慢性高血糖刺激后所發(fā)生的形 態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激變化；對相關(guān)細(xì)胞開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究，開展代謝組學(xué)分析；采用質(zhì)譜分析方法，檢測這些細(xì)胞外吐小體中的蛋白在病變前后的變化；綜合上述結(jié)果，闡明大血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生中的代謝和氧化應(yīng)激變化。 2. 2型糖尿病伴心血管病變患者的呼吸氣體代謝相關(guān)標(biāo)記分子的篩選：選取年齡、性別等嚴(yán)格匹配的正常人， 2型糖尿病患者， 2型糖尿病伴發(fā)心血管并發(fā)癥的人群為研究對象（每組 5060人），采用質(zhì)譜分析法，比較這些人群呼吸氣體中代謝相關(guān)有機成分的差異；采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較分析其血液和尿液標(biāo)本組別間 蛋白質(zhì)譜的差異。 3. GLP1用于糖尿病心血管病并發(fā)癥防治的基礎(chǔ)和臨床研究：體外觀察 GLP1對糖尿病動物模型和 ApoE（ /）基因敲除動物大血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響。體內(nèi)實驗中測定活體動物心血管指數(shù)的改善指數(shù)，主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的病理改變，和相關(guān)的氧化應(yīng)激分子表達(dá)的變化。在此基礎(chǔ)上，開展 GLP1的臨床前應(yīng)用研究。研究 GLP1對 2型糖尿病心血管并發(fā)癥患者的糖代謝、脂代謝、胰島素敏感性、胰島功能、心電圖、心功能等的影響。 經(jīng)費比例： 12% 承擔(dān)單位：南方醫(yī)科大學(xué)、同濟(jì)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 惠宏襄 學(xué)術(shù)骨干：陳義漢、孫云甫、唐永明、趙小寧 課題間相互關(guān)系 ： 課題 1可與課題 2緊密互動，通過不同樣本人群驗證遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用。課題 1和 2發(fā)現(xiàn)的易感基因和營養(yǎng)因素可在課題 6 中進(jìn)一步研究其對 β細(xì)胞功能、胰島素抵抗、糖尿病腎病和糖尿病大血管病變中的作用機制。課題 6 中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵因子可在課題 1中進(jìn)一步研究其是否參與中國人 2 型糖尿病及并發(fā)癥的遺傳易感性；在課題 2中研究其是否參與營養(yǎng)因素誘發(fā) 2型糖尿病的分子機制。課題 1和 2可為所有細(xì)胞應(yīng)激機制研究課題組提供臨 床標(biāo)本，以深化研究。 各課題與項目總體目標(biāo)和五年目標(biāo)的關(guān)系如下：課題 1著重開展影響 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的易感基因研究；并開展表觀遺傳學(xué)研究。該課題的研究成果可為 2型糖尿病及并發(fā)癥易感人群的早期檢出提供支持。該課題組還可提供臨床樣本支持，并提供葡萄糖鉗夾技術(shù)平臺與其他課題組共享。課題 2主要研究營養(yǎng)因素與 2型糖尿病的關(guān)系，以及遺傳因素與營養(yǎng)因素在 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展上是否存在交互作用。該課題有望為建立適合中國漢族人群遺傳背景和膳食特點的 2型糖尿病營養(yǎng)干預(yù)策略提供理論依據(jù)。課題 3圍繞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致胰島 β細(xì)胞凋亡的作用 機制開展研究，揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂肪酸和炎癥因子誘導(dǎo)的胰島 β細(xì)胞凋亡過程中的分子機制 , 為 2型糖尿病的治療提供潛在的新靶點。課題 4研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝臟胰島素抵抗中的作用，探討脂肪因子及肝細(xì)胞因子的代謝調(diào)節(jié)功能及分子作用機理，為脂肪因子及肝細(xì)胞因子用于 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的早期風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)及臨床依據(jù)。課題 5研究線粒體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎臟足細(xì)胞損傷和糖尿病腎病的作用機制，重點研究糖尿病足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、以及與足細(xì)胞生物學(xué)功能密切相關(guān)的線粒體能量代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。課題 6研究氧化應(yīng)激與 2型糖尿病大血管病變及心 臟病變的關(guān)系。 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 完成技術(shù)培訓(xùn)，完善人群和家系數(shù)據(jù)庫；完成組織樣本收集；在小樣本中進(jìn)行全外顯子組深度測序；構(gòu)建與 2型糖尿病有關(guān)的重要基因 /蛋白質(zhì)的信息庫；選取伴有和不伴有糖尿病的肝癌患者，分析肝癌患者的預(yù)后與糖尿病的關(guān)系；在基線病例和對照各 3000例中測定樣本端粒長度 篩選 300 名符合標(biāo)準(zhǔn)的患有代謝綜合征的志愿者，采用核桃、亞麻子或相同卡路里食物對照對所有志愿者進(jìn)行為期 3個月的臨床干預(yù)研究；測定紅細(xì)胞膜的各種脂肪酸組成和比例；觀察 TNFα、 MCP1對胰島 β細(xì)胞胰淀素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 確定及優(yōu)化細(xì)胞和小鼠模型；脂肪酸刺激 MIN6細(xì)胞后用明確候選基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)增加或降低的倍數(shù)；針對部分發(fā)生 2 倍以上變化的靶基因，在 Genebank 中搜索其啟動子區(qū)序列并 設(shè)計引物；脂肪酸刺激 MIN6細(xì)胞，用 FoxO1抗體做染色質(zhì)免疫共沉淀（ ChIP）實驗 。 建立 AFABP、 lipocalin2 KO 小鼠的葡萄糖鉗夾實驗、常規(guī)及高脂狀態(tài)下脂肪細(xì)胞因子水平及生理代謝狀態(tài)檢測、肝臟及脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能檢測；制備 FGF2 adropin、 CPT1A、 APPLAMPK r GPR11 Ahi、 ERRa 基因敲除小鼠；篩選對 AFABP功能有影響的小分子化合物；構(gòu)建 adiponectin、 AFABP和 lipocalin2轉(zhuǎn)基因兔載體；分析 miR29家族成員 miR29a、 miR29b、 miR29c的在肝臟的表達(dá)特征 觀察糖尿病小鼠模型腎小球足細(xì)胞數(shù)目和足突的變化與 UCP2蛋白表達(dá)變化的關(guān)系；利用 UCP2基因缺失小鼠與 STZ糖尿病動物模型，觀察足細(xì)胞數(shù)目和足突的變化，以及尿白蛋白和腎功能的變化，分析 UCP2基因缺失對足細(xì)胞結(jié)構(gòu) 與功能的影響；采用血管硬化動物模型觀察氧化損 建立完備的 2型糖尿病及其對照隊列，建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，包括端粒信息；完成小樣本全基因組測序工作，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫，選取多個 SNP用于進(jìn)一步研究；初步建立 2型糖尿病重要基因 /蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫平臺；闡明糖尿病對肝癌患者預(yù)后的影響 通過比較各組干預(yù)前后的變化和組間差異，評估核桃和亞麻子對代謝綜合征個體的健康改善效力；確定中國京滬城鄉(xiāng)居民脂肪酸的分布特征；明確 TNFα、 MCP1對胰淀素表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 確定 及優(yōu)化細(xì)胞和小鼠模型； 建立內(nèi)本實驗中質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的評判標(biāo)準(zhǔn)；進(jìn)一步優(yōu)化原代胰島的分離方法；尋找受 FoxO1直接調(diào)控的基因；驗證確定之前 ChIPDSL芯片結(jié)果的可靠性 初步了解 AFABP和 lipocalin2缺失對胰島素敏感性；檢測出 KO 小鼠與野生小鼠相比其脂肪氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激何線粒體功能出現(xiàn)的差別；獲得肝細(xì)胞因子FGF2 adropin基因敲除小鼠雜合子；獲得 CPT1A, APPL2， AMPK r GPR11Ahi、 ERRa等脂肪、肝臟和神經(jīng)細(xì)胞特異基因敲除小鼠；獲得對 AFABP 功能有影響的小分子化合物；獲得 adiponectin，AFABP 和 lipocalin2 轉(zhuǎn)基因兔載體；獲得初步 miR29a在肝臟的表達(dá)信息 成功建立 UCP2基因缺失小鼠與配對的野生型小鼠建立 STZ糖尿病動物模型，獲得足細(xì)胞病變相關(guān)數(shù)據(jù)，并比較差異；成功建立血管硬化動物模型，觀察獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，動脈組織勻漿組織因子活性和表達(dá)，以及 PAI1 和抗凝血因子的表達(dá)數(shù)據(jù) 闡明與 2型糖尿病大血管病變直接相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激變化圖譜；明確 GLP1對糖尿病動物的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 傷白蛋白慢性負(fù)荷對血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及血管活性物質(zhì)合成的作用，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，動脈組織勻漿組織因子活性和表達(dá)，以及 PAI1和抗凝血因子的表達(dá)。 觀察模型大鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞在經(jīng)由模擬糖尿病早期的慢性高血糖和高胰島素刺激后所發(fā)生的增殖、遷移和凋亡等形態(tài)學(xué)改變；測定細(xì)胞中主要 ROS 濃度，檢測線粒體功能和代謝變化；研究 GLP1對糖尿病動物模型的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響，體內(nèi)實驗測定活體動物心血管指數(shù)的改善情況，主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞病理 改變，相關(guān)的氧化應(yīng)激分子表達(dá)的變化 培養(yǎng)碩士、博士研究生 15名；在國際相關(guān)領(lǐng)域雜志上發(fā)表研究論 文 15篇 第 二 年 在北方和東部人群中開展大樣本易感基因關(guān)聯(lián)研究；完善與 2型糖尿病有關(guān)的重要基因 /蛋白質(zhì)的信息庫；選取重要靶組織，進(jìn)行全基因組甲基化富集；選取伴有和不伴有糖尿病的肝癌患者腫瘤及癌旁組織標(biāo)本，在組織芯片上檢測肝癌患者腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵因子表達(dá)水平的改變與糖尿病的關(guān)系；基線端粒數(shù)據(jù)與糖尿病的關(guān)聯(lián)分析，并完成第一次隨訪血樣的端粒長度檢測 完成測定紅細(xì)胞膜的脂肪酸測定，系統(tǒng)研究脂肪酸種類、數(shù)量和比例與炎性反應(yīng)和 2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；研究血漿 25羥基維生素 D水平與胰島素分泌、胰 島素抵抗和 2 型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，研究維生素 D相關(guān)基因的變異對維生素 D的影響，以確定中國人 25羥基維生素 D水平是否與遺傳背景密切相關(guān)，并研究基因型與維生素 D的相互作用對 2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的影響；探討 TNFα調(diào)節(jié)胰島 β細(xì)胞胰淀素表達(dá)的分子機制 研究脂肪酸對基因啟動子活性的影響；初步發(fā)現(xiàn)新的中國人 2型糖尿病易感基因；完善并發(fā)布 2型糖尿病重要基因 /蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫平臺；明確糖尿病在肝癌進(jìn)展過程中的關(guān)鍵因子；初步分析端粒長度與糖尿病的關(guān)系 確定中國京滬城鄉(xiāng)居民脂肪酸的分布特征，以及與 2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的 關(guān)系，膳食遺傳影響因素和對疾病的預(yù)測作用；在中國漢族人群中闡明 25羥基維生素 D水平、及其與相關(guān)基因多態(tài)性位點的交互作用對 2型糖尿病的發(fā)表風(fēng)險的影響；闡明 TNFα調(diào)節(jié)胰淀素表達(dá)的分子機制 闡明 FoxO1 干擾或者過表達(dá)后，候選基因啟動子活性變化的狀況及表達(dá)調(diào)控機制；在細(xì)胞功能水平闡明 FoxO1表達(dá)的增加或缺失對胰島 β細(xì)胞 GSIS 及數(shù)量的影響；確定在胰島 β 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中受FoxO1調(diào)控的基因 獲得脂肪細(xì)胞因子直接作用于肝臟細(xì)胞的證據(jù)；明確肝臟細(xì)胞因子對 lipocalinAFABP 基因缺失型脂 肪細(xì)胞生理功能的功效；篩出 lipocalin2， AFABP KO作用年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 檢測 FoxO1干擾或是過表達(dá)后，這些啟動子在脂肪酸處理后的活性變化、基因表達(dá)情況；考察 FoxO1 表達(dá)的增加或缺失對MIN6 細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌功能以及對細(xì)胞數(shù)目的影響；加入脂肪酸刺激，從胰島 β細(xì)胞功能以及細(xì)胞活力兩方面 評估候選基因的功能。 分離原代小鼠的肝細(xì)胞，研究重組lipocalin2， AFABP 及 adiponecin體外對小鼠肝細(xì)胞功能的影響；研究重組肝細(xì)胞因子 FGF21等對 lipocalin2， AFABP KO小鼠原代脂肪細(xì)胞的影響及肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能相關(guān)通路； FGF2adropin、 CPT1A, APPL2， AMPK r2等組織特異基因敲除小鼠的初檢；用兔胚胎成纖維細(xì)胞篩選 AFABP 和 lipocalin2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入細(xì)胞株 抑制足細(xì)胞 UCP2的表達(dá)，檢驗 UCP2表達(dá)是否是高糖 引發(fā)足細(xì)胞損傷必需；觀察抑制 UCP2蛋白的足細(xì)胞，在高糖作用下特定的重要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)與分布的變化；觀察纖維連接蛋白和整合素聯(lián)接激酶 (ILK)表達(dá)與分布的變化，分析 UCP2對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的影響，以及拮抗高糖作用的可能機制；觀察氧化損傷白蛋白對粘附分子表達(dá)、血管活性物質(zhì)合成及氧應(yīng)激的影響；采用雙室法研究其對血管內(nèi)皮通透功能的影響并觀察細(xì)胞骨架的變化。 觀察模型大鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞在經(jīng)由模擬糖尿病早期的慢性高血糖和高胰島素刺激后所發(fā)生DNA/RNA 損傷、氧化 /抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)、脂質(zhì)過氧化 、蛋白氧化等變化，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度；選取 2 型糖尿病病人和伴發(fā)心血管并發(fā)癥的人群為研究對象 ,采用質(zhì)譜分析法，比較這些人群呼吸氣體中代謝相關(guān)有機成分的差異；研究 GLP1對糖尿病動物模型內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響，采用 RNA 干擾和小分子抑制劑判斷GLP1 發(fā)揮作用的信號途徑 肝細(xì)胞所通過的信號傳導(dǎo)通路；進(jìn)一步確認(rèn) AFABP 小分子抑制劑的功效；獲得首批 FGF2 adropin基因敲除小鼠；初步檢測 CPT1A,APPL1, APPL2， AMPK rGPR11 Ahi、 ERRa 等在不同組織中的缺失對小鼠整體及肝臟功能的影響；獲得目的兔轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株；闡明 miR29 家族的作用機制以及導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的分子機制 體外轉(zhuǎn)染 UCP2 siRNA抑制其在足細(xì)胞的表達(dá)，檢驗得到一致 UCP2 表達(dá)對高糖引發(fā)足 細(xì)胞損傷影響的數(shù)據(jù)；觀察獲得氧化損傷蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的數(shù)據(jù) 闡明與 2型糖尿病大血管病變直接相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激變化圖譜；篩選出存在于糖尿病病人呼吸氣體中代謝相關(guān)分子標(biāo)記；明確 GL