南農(nóng)生物分離工程生物分離7親和-資料下載頁
2025-01-13 12:34本頁面
【正文】 果 ↑峰集中 一般蛋白＜ 3% ? 吸附平衡的流速 大分子配體與配基的吸附平衡需較長時間 高溫數(shù)小時，低溫數(shù)天 操作：先平衡、低流速＜ 10ml/c㎡ h 親和力大，流速快，抗原抗體 親和力小，流速慢，抑制劑、底物類似物與酶 非特異性吸附：離子效應、疏水基團 二、清洗 ? 清洗：與吸附操作相同的緩沖液，確定時間 ? 非特異性洗脫法 ? 非特異性洗脫通過調節(jié)洗脫液的 pH值、離子強度 （ NaCl%) 、離子種類或溫度等理化性質降低目標產(chǎn)物的親和吸附作用，是使用較多的洗脫方法。 純化幾個酶 抗原抗體降低緩沖液極性（加乙二醇） 加蛋白變性劑，洗脫后稀釋透析 ? 親和色譜洗脫方法 ? 特異性洗脫法 ? 利用含有與親和配基或目標產(chǎn)物具有親和結合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產(chǎn)物的 競爭性結合 ，脫附目標產(chǎn)物。 ? 例如： Lys和 Arg均為 tPA的抑制劑，利用固定化 Lys為配基親和分離 tPA時，可用 Arg溶液進行洗脫。 “ 正洗脫 ” 常用游離配基抑制劑、輔酶、底物、結構類似物 ? 利用 con A為配基的目標產(chǎn)物可用葡萄糖溶液洗脫。 ? 特異性洗脫法的 洗脫條件溫和 ，有利于保護目標產(chǎn)物的生物活性，另外，由于僅特異性洗脫目標產(chǎn)物，對于特異性較低的親和體系（例如，用三嗪類色素為配基時）或非特異性吸附較嚴重的物系，特異性洗脫法有利于提高目標產(chǎn)物的純度。 “負洗脫 ”：酶必須先結合 A才能結合 B，一般選 A 作配基，若選 B作配基，流動相含 A， 洗脫時不含 A 如 NADH使乳酸脫氫酶吸附在固定化丙酮酸類似物上，洗脫液中不含 NADH，脫氫酶被洗脫 再生 通常無需再生 非特異性吸附由于變性蛋白沉積，用 6mol/L脲 提純 tPA、干擾素 干擾素：細胞誘導產(chǎn)生，雜蛋白多， (NH4)2SO4 沉淀，凝膠過濾，離交，電泳，產(chǎn)率 10% 親和層析，一步提純 3600倍，活力回收率高 應用舉例 1. tPA的純化 ? 組織纖溶酶原激活劑（ tPA）是一種糖蛋白，具有激活纖溶酶原、促進血纖維蛋白溶解的作用，是治療血栓等心腦血管疾病的蛋白藥物。 ? 賴氨酸、精氨酸、氨基芐脒和纖維蛋白與 tPA具有親和結合作用，常用做親和色譜純化 tPA的配基。 ? 圖 53是利用精氨酸 Sepharose 4B親和色譜法純化豬心組織 tPA的結果。原料為豬心丙酮粉經(jīng)醋酸鉀抽提、硫酸銨沉淀。 圖 53 精氨酸 Sepharose 4B 親和色譜 2. 干擾素的純化 ? 干擾素（ interferon， IFN） 對癌癥、肝炎等疾病具有特殊療效。 ? IFN主要分 α、 β和 γ三種類型 ， 可通過動物細胞培養(yǎng)或重組 DNA大腸桿菌發(fā)酵大量生產(chǎn) 。 ? 色素親和色譜 、 固定化金屬離子親和色譜和免疫親和色譜可用于 IFN的純化 。 ? 如圖 53是利用單抗免疫親和色譜法純化源于大腸桿菌的重組人白細胞干擾素 （ rhIFN α）的操作條件和結果 。 rhIFN α的比活提高了1150倍 ， 收率達 95％ 。 圖 54 單抗免 疫親和色譜法 純化 rhIFNα ? 1凝膠層析的原理是什么？ ? 2 親和層析的原理是什么？ ? 3例舉三種以上親和作用的分子對。
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