人教版教學課件選修1專題5課題3血紅蛋白的提取和分離-資料下載頁
2025-01-13 04:04本頁面
【正文】 mL， 10%的過硫酸胺 mL， TEMED ，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間 (梳子的齒長再加 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高 2— 3 mm），以阻止氧氣進入凝膠溶液。 ②分離膠聚合完全后（約 30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 ③配制 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水 mL，30%的丙烯酰胺 mL， mol、 pH Tris緩沖液 mL，10%的 mL， 10%的過硫酸胺 mL， TEMED mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。 整個操作過程應注意避免氣泡的產生。然后再補加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放臵于室溫下聚合。 （ 1）根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板 （ 2） SDS— 聚丙烯酰胺凝膠制備： 電泳方法步驟 （ 3）樣品處理： 在電泳樣品中按 1∶1 體積比加入樣品處理液，在100 ℃ 溫度下加熱 3 min，以使蛋白質變性。 （ 4）濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝臵上，上下槽各加入 Tris— 甘氨酸電泳緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。 （ 5）加樣： 按順序加樣，加樣量通常為 10— 25 μL 。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后 (即進行凝膠色譜分離之前 )的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品 （ 6）電泳： 將電泳裝臵與電源相接，凝膠上所加電壓為 8 V/cm。當染料前沿進入分離膠后，把電壓提高到 15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約 1 cm處，關閉電源。 （ 7）剝膠： 從電泳裝臵上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標注凝膠的方位。 （ 8）染色： 將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍染色液中染色 12 h。 （ 9）脫色： 染色完畢，傾出染色液 ,換脫色液脫色 310 h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。 （ 10）觀察結果： SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質與 SDS的結合程度。 電泳方法步驟 觀察你處理的血液樣品離心后 是否分層 （見教科書圖 518）， 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 三、實驗結果分析與評價 你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質， 例如藍色葡聚糖 — 2022或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出； 如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。 你能觀察到蛋白質的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？ 三、實驗結果分析與評價 本課題作業(yè) 。 ? ?它的作用是什么 ? ? ? ,紅細胞有什么特點 ?這一特點對你進行 蛋白質的分離有什么意義
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