分子生物學試題word版-資料下載頁
2025-01-11 01:26本頁面
【正文】 55％。 3’端和 5’端引物具有相似的 Tm值 ,Tm值計算公式： Tm＝ 4(G+C)+ 2(A+T) 引物自身不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結構。引物的連續(xù)互補序列，一般不超過 3bp。 兩個引物之間不應存 在互補序列，尤其應避免 3’端的互補重疊。 引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不超過 70％，引物 3’末端連續(xù) 8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。 引物 3’端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板 DNA配對。引物 3’端最佳堿基選擇是G和 C，形成的堿基配對比較穩(wěn)定。 引物與模板結合時，引物的 5’端最多可以游離十幾個堿基而不影響 PCR反應的進行。 引物的 5’端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子 等 （十八）、 PCR的反應條件？ 答： PCR反應的緩沖液： ? TrisHCl緩沖液 ? KCl 促進引物的退火，濃度太高時會抑制 Taq DNA聚合酶活性。 ? 加入 BSA或明膠有利于保護 TaqDNA聚合酶活性。 ? 必要時加入適量二甲基亞砜 (DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結構，提高 PCR 反應特異性。 鎂離子濃度 一般用量 mmol/L， Taq DNA聚合酶活性需要 Mg 2+。 Mg 2+濃度過低，會顯著降低酶活性。 Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。 Mg 2+濃度還會影響引物的退火、模板與 PCR產物的解鏈溫度，從而影響擴增片段的產率。 底物濃度 工作濃度 20200umol/L， dNTPs 濃度過高可加快反應速度，也增加堿基的錯配率和實驗成本。降低濃度會導致反應速度下降，可提高反應的特異性。在 PCR 反應中， 4 種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少 PCR反應的錯配誤差并提高使用效率。 Taq DNA 聚合酶 7580℃ 時具有最高的聚合酶活性， 150 個核苷酸 /秒；具有良好的熱穩(wěn)定性， 95℃ 仍有活性，應用濃度一般為 。 引物 。引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴增、生成引物二聚體，使目的 DNA片段產率下降。退火溫度與引物 Tm值有關，引物 Tm值在 5580 ℃ 范圍較為理想。 反應溫度和循環(huán)次數 （十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達的因素？ 答： 啟動子的強弱； 基因的劑量； 影響 RNA轉錄和翻譯效率的因素： SD序列、 mRNA；外源基因密碼子的選擇； 表達產物的大小； 表達產物的穩(wěn)定性。 （二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達外源基因必須具備的條件？ 答： 要求外源基因的編碼區(qū)不能 含有內含子； 表達的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游，并形成正確的閱讀框架； 轉錄出的 mRNA必須有與大腸桿菌 16S rRNA3，末端相匹配的 SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質。 蛋白產物必須穩(wěn)定，不易被細胞內蛋白酶快速降解，且對宿主無害。 （二十一）、真核細胞表達外源基因的條件？ 答： 首先必須具備哺乳動物細胞表達的功能元件。要求哺乳動物細胞表達載體帶有能在真核細胞中表達外源基因的真核轉錄調控元件； 注意選擇轉染的受體細胞，不同類型的細胞具有不同的特性； 注意選擇適當的選擇標記。 （二十二）、轉基因動物的概念、原理及應用？ 答： 概念：是指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內，并能穩(wěn)定傳代的一類動物。它的特點是 “分子及細胞水平操作，組織及動物整體水平表達 ”。 基本原理：將目的基因或基因組片段用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉基因動物，人們可以通過分析轉基因和動物表型的關系，揭示外源基因的功能；也可以通過轉入外源基因培育優(yōu)良的動物品種。 應用：建立用于研究外源基因表達調控體系；建立醫(yī)學中常用的疾病模型；培育動物新品種；藥理學和藥用蛋白的生產研究。 （二十三）、基因敲除的基本程序？ 答：通過 DNA同源重組，使得胚胎干細胞特定的內源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過胚胎干細胞介導得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為基因敲除。 打靶載體的構建：同源序列要足夠長，要含有篩選用的標志基因。 胚胎干細胞的體外培養(yǎng) 打靶載體導入胚胎干細胞 同源重組胚胎干細胞的篩選 基因敲除胚胎干細胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 雜交育種獲得純合的基因敲除動物 （二十四）、 DNA芯片的原理？ 答： DNA 芯片技術就是一種大規(guī)模的集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息。其方法包括芯片的制備、樣品的準備、分子雜交和檢測分子。 （二十五）、誘變劑的作用機制？ 答： 堿基的類似物誘發(fā)突變 改變 DNA的化學結構 結合到 DNA分子上誘發(fā)移碼突變 紫外線及其他射線引起的 DNA分子的變化 （二十六）、突變類型及其遺傳效應？ 答： 突變類型： ① 點突變： DNA大分子上一個堿基的變異。分為轉換和顛換。 ② 缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從 DNA大分子上消失。 ③ 插入：一個原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到 DNA大分子中間。 ④ 倒位： DNA鏈內重組，使其中一段方向倒置。 突變的遺傳效應： ① 遺傳密碼的改變：錯義突變、無義突變、同義突變、移碼突變 ② 對 mRNA剪接的影響：一是使原來的剪接位點消失；二是產生新的剪接位點。 ③ 蛋白質肽鏈中的片段缺失： （ 二十七）、基因治療的策略？ 答： 基因置換或稱基因矯正：特定的目的基因導入特定的細胞，通過定位重組，讓導入的正?；蛑脫Q基因組內原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。
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