[基礎(chǔ)科學(xué)]細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)解答-資料下載頁(yè)
2025-01-08 20:04本頁(yè)面
【正文】 的含量將決定 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 時(shí)，則應(yīng)使用 5%CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。 ，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？ 答：除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株 (包括懸浮性細(xì)胞 )，在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 1015ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。 ？ 答 ：取出冷凍管后，須立即放入 37℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1－ 2 分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺(tái)操作細(xì)胞，用 75％消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。 ？ 答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和 ％的臺(tái)盼蘭溶液按 1:1 混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板，置于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，因活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，不被染色。 ，細(xì) 胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 18106 cells/ml vial 。 ？ 答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 9 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。 ？ 答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí)，研究者可能試圖 消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查 HEPA 過(guò)濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。 1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。 2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范 圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素 B推薦下列濃度， ， ， ， ， , mg/ml。 3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度 2－ 3 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 2－ 3 代。 5)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。 6)重復(fù)步驟 4。 7)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4－ 6代，確定污染是否以已被消除。 ？解決辦法有哪些？ 答：可能的原因有培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú) CO2；培 養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積等。解決辦法可以檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi) CO2 濃度，檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；取新的保存細(xì)胞種；檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓等；換入新鮮培養(yǎng)液等。 ？ 答：可以從國(guó)內(nèi)多家代理廠家買到 ATCC或 ECACC 的細(xì)胞株，同時(shí)國(guó)內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方還有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 (協(xié)和醫(yī)科大學(xué) )基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所以及武漢大學(xué)冷藏中心等。 ？ 答：細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞 對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓 290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在 320mOsm/kg 左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在 260－ 320mOsm/kg 的范圍都適宜。 (mycoplasma) 污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？ 答：不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。 ？ 答： ATCC (American Type Culture Collection) 收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開 ATCC 網(wǎng)頁(yè)的 Cells and hybridomas 鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索 ATCC 的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述，包括細(xì)胞的來(lái)源，培養(yǎng)和凍存條件，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液 ? 答：胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過(guò) 30 分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定
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