【正文】 在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的 pH 值和離子強(qiáng)度影響。 pH 值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。 4． 離子對(duì)色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù) 被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。 離子對(duì)色譜法常用 ODS 柱（即 C18），流動(dòng)相為甲醇 水或乙腈 水，水中加入 3~10 mmol/L 的離子對(duì)試劑，在一定的 pH 值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保 留 時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng) 相組成及其 pH 值、離子強(qiáng)度有關(guān)。 5． 排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物第二部分 色譜分析 17 可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分 排阻能力 的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。 第二節(jié) 基本概念和理論 一、基本概念和術(shù)語 下面介紹一下 HPLC 中常用的術(shù)語及符號(hào)： 容量因子（ k＇）：表示某一溶質(zhì)在色譜柱中任意位置達(dá)到平衡后，該溶質(zhì)在固定相中的量與在流動(dòng)相中的量之比。 分配系數(shù)（ K）：分配色譜中是指溶質(zhì)在固定相中的濃度與溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度之比；吸附色譜中是指吸附劑單位表面積或重量所吸附的量與溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度之比。 柱體積（ Vc）：色譜柱的幾何體積，等于柱長(zhǎng)（ L）截面積（ Ac） 柱間隙體積（ VI）：填充柱柱流動(dòng)相所占有的體積。 死體積（ VM）：進(jìn)樣點(diǎn)和檢測(cè)點(diǎn)之間所包含的流動(dòng)相體積，相當(dāng)于非保留溶質(zhì)的保留體積。 保留時(shí)間（ tR）：從進(jìn)樣開始至記錄組分峰最大值所經(jīng)過的時(shí)間。 流動(dòng)相保留時(shí)間（ tM）：非保留溶質(zhì)的保留時(shí)間。 相對(duì)保留時(shí)間（ tR＇）： tR － tM 。 流量（ F）：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)通過色譜柱的流動(dòng)相體積。 線流速（ u）：非保留溶質(zhì)在色譜柱中的線速度 u=L/ tM 。 二、液相色譜熱力學(xué)基礎(chǔ) 混和物中不同組分在兩相間平衡分配的差異是色譜法作為一種分離技術(shù)的依據(jù)。在一支色譜柱中，只有當(dāng)被分離組分處于流動(dòng)相中時(shí)，它才能隨流動(dòng)相的移動(dòng)通過色譜柱。因此，某一組分在兩相間的分配有利于固定相時(shí)，該組分在色譜柱中逗留的時(shí)間就長(zhǎng)。換句話說，組分的保留行為是其平衡分配性質(zhì)的函數(shù)。正是組分之間平衡分配性質(zhì)的不同使得色譜分離成為可能。與物質(zhì)的分配平衡有關(guān)的問題就屬于色譜熱力學(xué)的范疇。 溶質(zhì)通過色譜柱的速度或保留值的大小取決于溶質(zhì)在兩相間分配的熱力學(xué)性質(zhì)，是由每一瞬間該溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分子分?jǐn)?shù)所決定的。分配在固定相中的分子不能隨流動(dòng)相通過柱子。容量因子 k＇大的溶質(zhì)，其分子大部分留在固定相中，因而通過色譜柱的速度低，保留值較大。溶質(zhì)的保留值（以保留時(shí)間 tR 表示）與容量因子、柱長(zhǎng)和流速的關(guān)系可以用如下方程式表示： L tR＝ （ 1＋ k＇） （ 3－ 1） u 從上式我們可以看出，保留值與色譜柱長(zhǎng)成正比，與流速成反比。由于流速可以通過柱長(zhǎng) L 與流動(dòng)相的保留時(shí)間 tM 的比值求得，我們可以將式（ 3－ 1）改寫為： tR － tM k＝ （ 3－ 2） tM 由此我們可以通過某溶質(zhì)峰的保留時(shí)間與非保留溶質(zhì)峰的保留時(shí)間來計(jì)算溶質(zhì)的容量因子 k＇。需要注意的是，在準(zhǔn)確計(jì)算容量因子時(shí)，還應(yīng)考慮到柱外體積的校正。 我們 知道，有兩個(gè)因素決定色譜峰相互重疊的程度：峰尖的間距和峰寬。如果保持峰寬不變，加大峰間距，則色譜峰的重疊程度減小，分離得到改善；如果保持峰間距不變，而使峰的寬度減小，同樣可以使色譜峰的重疊程度減小，分離得到改善。因此我們對(duì)峰的分離第二部分 色譜分析 18 度作如下定義： 相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。 式中 α是分離因子，其定義為兩種溶質(zhì)相對(duì)保留值之比，從本質(zhì)上講，α代表了溶質(zhì)之間平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異。 n 是色譜柱的理論塔板數(shù)，這里我們先來介紹一下塔板理論。塔板理論是 Martin 和 Synger 首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色塔板理論譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為： 1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。 2） 樣品加在第 0 號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。 3） 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。 4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。 從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：① 增加塔板數(shù)。方法之一是 增加柱長(zhǎng)，但這樣會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。 ② 增加選擇性。當(dāng) α＝ 1 時(shí)， R＝ 0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性： a. 改變流動(dòng)相的組成及 pH 值； b. 改變柱溫；c. 改變固定相。 ③ 改變?nèi)萘恳蜃印＿@常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。 k2趨于 0 時(shí)， R 也趨于 0； k2 增大， R 也增大。但 k2 不能太大，否則不但分離時(shí)間延長(zhǎng)，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測(cè)靈敏度。一般 k2 在 1~10 范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。 三、 色譜動(dòng)力學(xué) 1．液相色譜速率方程 1956 年荷蘭學(xué)者 Van Deemter 等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論 —— 速率理論。它把色譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬（即柱效）的影響。 后來 Giddings和 Snyder等人在 Van Deemter方程（ H＝ A＋ B/u＋ Cu，亦稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即 Giddings 方程）： H＝ A＋ B/u＋（ Cm＋ Cs） u 其中 Cm 為流 動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)， Cs 為固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)。 2．影響柱效的因素 ① 渦流擴(kuò)散（ eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng) A＝ 2λdp， dp 為填料直徑， λ 為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻 λ 越大。液相色譜中常用填料粒度一般為 3~10μm，最好 3~5μm，粒度分布 RSD≤ 5%。但粒度太小難于填充均勻（ λ 大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻， λ 越小?？偟恼f來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料， A＝ 0。 ② 分子擴(kuò)散（ molecular diffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng) B/u＝ 2γDm/u。 u 為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長(zhǎng)（ u 小），展寬越嚴(yán)重。在低流速時(shí)，它對(duì)峰形的影響較大。 Dm 為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的 Dm 很小，通常僅為氣相的 104~105，因此在 HPLC 中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。 γ 是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能 自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對(duì)Dm 進(jìn)行校正。 γ一般在 ~ 左右，毛細(xì)管柱的 γ＝ 1。 ③ 傳質(zhì)阻抗（ mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、第二部分 色譜分析 19 轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng) Cu 又分為三項(xiàng)。 Hm＝ Cmd2pu/Dm， Cm 為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。 Hsm＝ Csmd2pu/Dm， Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。 Hsm 對(duì)峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。 Hm 和 Hsm 都 與固定相的粒徑平方 d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù) Dm 成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大 Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。 Hs＝ Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs 為常數(shù)， df 為固定液的液膜厚度， Ds 為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中 Hs 與 df 的平方成正比，在吸附色譜中 Hs 與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中， Hs 才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí) Hs 可以忽略。 從速率方 程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施： 。 粒度要小。 。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。 流速。以 H 對(duì) u 作圖，則有一最佳線速度 uopt，在此線速度時(shí)， H 最小。一般在液相色譜中， uopt 很?。ù蠹s~），在這樣的線速度下分析樣品需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般來說都選在 1mm/s 的條件下操作。 測(cè)器死體積。 3．柱外效應(yīng) 速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即 柱外效應(yīng) （色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即： σ2＝ σ2 柱內(nèi)＋ σ2 柱外＋ σ2 其它 柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測(cè)池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對(duì)接宜呈流線形，檢測(cè)器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。其次，希望將樣品直 接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。 柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子 k 小的組分（如 k＜ 2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯； k 大的組分影響不顯著。由于 HPLC 的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（ N 越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典 LC 中則影響相對(duì)較小。 第三節(jié) 高效液相色譜儀 最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長(zhǎng)的檢測(cè)器、繪圖儀組成，繪出的峰要通過手工測(cè)量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測(cè)器從單波 長(zhǎng)到可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測(cè)器直至可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測(cè)器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡(jiǎn)單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。 目前常見的 HPLC 儀生產(chǎn)廠家國(guó)外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公司）、島津公司等，國(guó)內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。 第二部分 色譜分析 20 下面對(duì)液相色譜儀的主要組成部分的構(gòu)造、性能及使用中的注意事項(xiàng)作一簡(jiǎn)單介紹。 一、輸液泵 1．泵的構(gòu)造和性能 輸液泵是 HPLC 系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和 分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能： ① 流量穩(wěn)定，其 RSD 應(yīng)＜ %，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要； ② 流量范圍寬，分析型應(yīng)在 ~10 ml/min 范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到 100 ml/min； ③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300 kg/cm2； ④ 液缸容積??； ⑤ 密封性能好，耐腐蝕。 表 3－ 2 各品牌 輸液 泵的基本參數(shù) 項(xiàng)目 Waters 515 型 HP 1100 型 LC10ATvp 型 Elite P200 II 型 檢定要求 流速范圍 ~10 ~10 ~ ~ / 調(diào)節(jié)精度 / 流量精密度 RSD % %（ %）