【正文】 （如樣液 8 克 /毫升）時(shí)也可點(diǎn) 10 微升。 將薄層板邊緣上附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端 3 厘米的基線上，用進(jìn)樣器滴加樣液，一塊可以滴加四個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距離約為 1 厘米，點(diǎn)直徑應(yīng)掌握在 3毫米以內(nèi)為好，在同一板上滴加的點(diǎn)應(yīng)大小一致，在滴加樣液的時(shí)候，可以吹風(fēng)機(jī)吹冷風(fēng)邊吹邊點(diǎn)。如需自己制板，方法如下： 稱取硅膠 G 約 3 克（或稱取硅膠 85 克與石膏粉 15克，充分混合均勻后稱取 3 克）加相當(dāng)于硅膠 2－ 3 倍的水在玻璃乳缽中研磨 1－ 2 分鐘，至成均勻的糊狀后立即倒入涂布器內(nèi)，推成 5 12 厘米，厚約 毫米的薄層板 3 塊。以下按①操作。 ⑥適用發(fā)酵用曲種及菌株 稱取樣品 10 克于具塞三角燒瓶中，加入正已烷 30毫升與甲醇水（ 55+45） 80 毫升，振蕩半小時(shí)，用脫脂棉過濾于分液漏斗中，取 出甲醇水溶液 32 毫升（相當(dāng)于樣品 4 克）于另一分液漏斗中，加入 30 毫升氯仿提取。 注：以上檢品極易乳化，實(shí)在分不開層時(shí)，可采用離心分層的辦法。 第二法：稱取樣品 10 克移于分液漏斗中，加甲醇12 毫升（以醬油代替水，故甲醇與水體積比仍約為55+45）加氯仿 20 毫升提取，以下自振搖 2 分鐘起，按①操作，最后加苯乙腈 毫升，每毫升相當(dāng)于樣品 4第二部分 色譜分析 5 克。 ③適用于醬油、醋，方法有二： 第一法：稱取樣品 10 克于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加氯化鈉 4 克，移于分液漏斗中，燒杯用氯仿15 毫升分次洗滌，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振搖 2 分鐘，靜止分層后按第①操作。 ②適用于花生油、香油、芽籽油等。將脫油后的樣品移于 250 毫升具塞三角燒瓶內(nèi)，進(jìn)行檢驗(yàn)。 ［注］加入氯仿振搖 2 分鐘如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使 分層或用電吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)促使分層。將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥內(nèi)于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在水浴上冷卻 2－ 3 分鐘，準(zhǔn)確加入苯乙腈 1 毫升。另備一漏斗底部鋪脫脂棉少許，再加無水硫酸鈉 10 克，下接 60 毫升蒸發(fā)皿，漏斗中的無水硫酸鈉先用氯仿濕潤。 （三）、儀器 （可以自制） ： 5 20 厘米 ：（層析）內(nèi)長 25 厘米，寬 6 厘米，高 4厘米 － 10 毫升刻度吸管 ： 365nm， 220v， 125w，啟動電流 ： 20 微升， 10 微升 ： 125 毫升 ： 60 毫升 ：具塞 2 毫升 ：在索氏脂肪提取器以氯仿提取 2 小時(shí)揮干備用 （四）、操作方法 ①適用于大米、玉米、麥類、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等。 第二部分 色譜分析 4 ②稀釋液Ⅰ（ 微克 /毫升）取儲備液加苯乙腈混合液稀釋。 ①標(biāo)準(zhǔn)儲備液（ 微克 /毫升）： GBW(E)090015嚴(yán)格控制、應(yīng)加鎖于冰箱中避光存放。 G：薄層層析用 ：取苯 98 毫升，乙腈 2 毫升，混勻冰箱存放備用。 七 應(yīng)用實(shí)例 — TLC測定黃曲霉毒素 B1 （一）、原理 根據(jù)黃曲霉毒素 B1 能在波長 365 毫微米紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光的特性，采取薄層層析法，將樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，利用其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定其含量。 b. 目測法 將被測樣品和系列溶液點(diǎn)在同一薄層板上，展開后用適當(dāng)方法 顯色，可以得到系列斑點(diǎn)，將被測樣品的斑點(diǎn)面積大小和顏色與標(biāo)準(zhǔn)系 列的斑點(diǎn)相比較，可推測出樣品的含量范圍。 a. 斑點(diǎn)面積測量法 以半透明紙掃下 TLC 圖上的斑點(diǎn)界限，然后測量其面 積。 b. HPLC 法 以 TLC 法斑點(diǎn)洗脫液直接作 HPLC分離和定量 c. GC 法 以 TLC 法斑點(diǎn)洗脫液直接作 GC 分離和定量。用來洗脫組分斑點(diǎn)的溶劑，對下一步定量方法應(yīng)無影響。 TLC 間接定量的關(guān)鍵是斑點(diǎn)組分的定量洗脫。 板上化學(xué)反應(yīng)定性主要有以下兩種方式： a. 反應(yīng)后生成特征顏色的化合物，借以鑒 定反應(yīng)物； b. 反應(yīng)后生成復(fù)雜的、無法鑒定組分的混和物，但可根據(jù)生成物的“指紋” 特征加以鑒定； c. 除以上兩種定性反方法外，還有板上光譜定性、 TLC 與其他聯(lián)用技術(shù)間 接聯(lián)用定性、薄層色譜－傅里葉變換紅外光譜聯(lián)用定性以及薄層色譜－質(zhì)譜聯(lián)用定性。Rf 值的準(zhǔn)確測定受多方面因素影響，為了增加 Rf 值定性的可靠性，必須通過改變色譜系統(tǒng)的選擇性，重復(fù)測定第二部分 色譜分析 3 同一化合物的 Rf 值。采用化學(xué)試劑顯色時(shí)，通過手動或電動噴霧器向展開好的薄層板噴灑顯色試劑。 六 薄層色譜定性定量方法 （一）斑點(diǎn)定位 斑點(diǎn)定位必須采用非破壞性方法。 （ 二 ） 主要功能 薄層色譜掃描儀主要用于 TLC 圖被分離斑點(diǎn)和薄層空白的光學(xué)相應(yīng)信號測 量。 ： ； ，與展開劑和樣品組 成不起化學(xué)反應(yīng)或分解作用； ； 。 除以上兩種展開機(jī)制外，還有化學(xué)鍵合 相展開和離子交換展開。流動相依其極性可在吸附劑表面形成單分子或雙分子溶劑吸附層，展開過程中，組分的保留及分離選擇性主要有以下三種因素決定： a. 溶劑對樣品的溶解能力； b. 溶質(zhì)和流動相分子對固定相表面活性吸附位點(diǎn)的競爭； c. 溶質(zhì)分子與吸附劑表面上吸附中心間的特殊作用力。 （二）幾種常用薄層色譜分離模式的展開機(jī)制 在 TLC分離中，液固展開是一種最經(jīng)典的展開方式。 (4)混合流動相之間發(fā)生作用會使溶劑性質(zhì)改變。 (2)溶劑吸收環(huán)境水分，會使極性等性質(zhì)改變。與 HPLC同理，對復(fù)雜樣品的分離能否得到理想的結(jié)果，流動相的選擇是最重要的因素 之一 ，不同溶質(zhì)與流動相分子、第二部分 色譜分析 2 固定相分子間的作用力不同，因此其移動速度也不同，最終 導(dǎo)致 樣品中各組分的分離。薄層展開 有 三種形式，直線式展開方式為實(shí)際應(yīng)用中使用最普遍的展開方式。 （四）展開 TLC 展開就是流動相沿薄層（固定相）運(yùn)動，以實(shí)現(xiàn)樣品混合組分分離的過程。樣品原點(diǎn)一般在 1mm 左右為佳，原點(diǎn)過大或樣品量過大，會導(dǎo)致分離變壞。 μ L1，點(diǎn)樣體積視點(diǎn)樣技術(shù)不同而異。離子型化合物樣品， 常需先衍生化成在揮發(fā)性強(qiáng)、極性小的溶劑中易溶解的樣品衍生物。 （三）點(diǎn)樣 點(diǎn)樣是 TLC 分離和精確定量的關(guān)鍵。 TLC 固定相薄層涂鋪大多采用濕法勻漿，要求薄層均勻、平整、無氣泡、不易造成凹坑和龜裂。加入熒光指示劑后，可以使這些化合物斑點(diǎn)在激發(fā)光波照射下顯出清晰的熒光，便于檢測。常用的粘合劑可分為無機(jī)粘合劑和有機(jī)粘合劑兩類。硅膠和氧化鋁是最常用的兩種未改性固定相。 （ 1）載體 對 TLC 載體 的基本要求為：機(jī)械強(qiáng)度好、化學(xué)惰性好（對溶劑、顯色劑等）、耐一定溫度、表面平整、厚度均勻、價(jià)格適宜?？赏ㄟ^改變涂層材料的化學(xué)組成或?qū)Σ牧媳砻孢M(jìn)行化學(xué)改性來實(shí)現(xiàn)改變薄層色譜分離的選擇性。 薄層色譜法具有技術(shù)比較簡單，操作容易，分析速度快，高分辨能力，結(jié)果直觀，不需 昂貴儀器設(shè)備就可以分離較復(fù)雜混合物等特點(diǎn)。被分離的樣品溶液點(diǎn)加在薄層板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流動相（深度約 5mm）的密閉缸中，進(jìn)行色譜展開，實(shí)現(xiàn)混合組分分離。第二部分 色譜分析 1 第二部分 色譜分析 第一章薄層色譜法（ TLC） 一 薄層色譜法概述 薄層色譜法是一種基于混合物組分在固定相和流動相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法。與HPLC 不同， TLC 將固定相涂鋪在栽板上，使之形成均勻的薄層。被展開的組分斑點(diǎn)即色譜譜帶，通過適當(dāng)技術(shù)對色譜譜帶進(jìn)行處理可得到定性和定量的檢測結(jié)果。 二 薄層色譜法中的薄層板、薄層板的涂鋪、點(diǎn)樣和展開 （一）薄層板 TLC 分離的選擇性主要取決于固定相的化學(xué)組成及其表面的化學(xué)性質(zhì)。此外，固定相的物理性質(zhì)，如比表面積、比空容、平均孔徑等也對其色譜行為產(chǎn)生影響。 （ 2）固定相 TLC 固定相包括改性固定 相和未改性固定相兩類。 （ 3）粘合劑 在制備薄層板時(shí)，一般需在吸附劑中加入適量粘合劑，其目的是使吸附劑顆粒之間相互粘附并使吸附劑薄層緊密的附著在載板上。 （ 4）熒光指示劑 熒光指示劑是便于在薄層色譜圖上對一些基本化合物斑點(diǎn)（無顏色斑點(diǎn)、無特征紫外吸收斑點(diǎn)）定位的試劑。 （二）薄層板的涂鋪 涂板方法可以分為涂布法、傾注法、噴灑法及浸漬法四 類，其中涂布法是應(yīng)用最廣泛的涂板方法。 薄層板活化處理可以獲得適宜活性，提高色譜分離效率和選擇性。不同種類的 樣品 常需選用不同的配樣溶 劑，一般采用易揮發(fā)的非極性或弱極性溶劑配樣。最適合點(diǎn)樣的樣品濃度應(yīng)為（ 1～ 5） μ g TLC 定量分析時(shí)，樣品量的適宜范圍為最小檢出 量的幾倍至幾十倍。點(diǎn)樣步驟一般占 TLC 全部分析時(shí)間的三分之一左右，所以使點(diǎn)樣儀器化、自動化，既快又準(zhǔn)，獲得好的重復(fù)性，是 TLC 工作者所期盼的。這一過程需在具有一定形狀的展開室中進(jìn)行。 三 薄層色譜流動相與展開機(jī)制 （一）對流動相溶劑選擇的基本考慮 薄層色譜溶劑的選擇對分離的影響很大。對流動相的選擇不僅需考慮極性、選擇性等因素，更基本的應(yīng)注意以下因素的影響： (1)溶劑純度，含有雜質(zhì)影響分離。 (3)存放條件不適宜或貯存時(shí)間過長，溶劑會變性。溶劑極易揮發(fā)，流動相組成隨時(shí)改變。液固展開常用極性吸附硅膠、氧化鋁作固定相。 與液液分配柱色譜分配機(jī)理相同，組分在互不相溶的兩液相中的溶解度不同，因此遷移速率存在差異，在遷移過程中得到分離。 四 薄層色譜吸附劑與載體的選擇 ： ； ，因而能較好的分離不同的化學(xué)組分； 不 溶解； 、溶劑和展開劑起化學(xué)反應(yīng)或破壞、分解作用 、在使用過程中不會碎裂 ，既能吸附樣品組分，又易于解吸； ，最好是白色固體。 五 薄層色譜掃描儀 （一）儀器結(jié)構(gòu) TLC 掃描儀結(jié)構(gòu)主要包括光學(xué)元件組合系統(tǒng)、電子元件組合系統(tǒng)及機(jī)械元件組合系統(tǒng)。要求儀器光源穩(wěn)定，光波單色性能好，光波長在（ 200～ 800nm）檢測器靈敏度高。當(dāng)斑點(diǎn)紫外光顯示時(shí)，可采用長波長和短波長紫外燈，使用 方便、靈活。 （ 二 ） 定性方法 在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物的 Rf 值一定，比較未知物和標(biāo)準(zhǔn)物的 Rf 值，能夠作為鑒定未知物的依據(jù)。如果在分離機(jī)理不同的色譜體系中，比較 Rf 值仍能得到肯定的結(jié)果，那么其可靠性將更大。 （ 三 ） 定量方法 間接定量法就是將 TLC 已分離的物質(zhì)斑點(diǎn)洗脫下來，再采用其他方法對該洗脫液進(jìn)行定量分析。選用怎樣的洗脫方法，取決于，組分和薄層吸附劑的性質(zhì)。 a. 分光光度 法 將下來的洗脫液配制成標(biāo)準(zhǔn)體積，再同樣條件下對樣品和 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行吸光值測量。 d. 質(zhì)譜法 采用組分質(zhì)譜圖中的特征離子峰可進(jìn)行定量。將斑點(diǎn)面積同平行操作的標(biāo)準(zhǔn)樣面積相比較進(jìn)行定量。這種定量法非常適用于對常規(guī)大量樣品的重復(fù)分析。 （二）、試劑 ：沸程 30－ 60℃ ：如不是無水乙醚，則應(yīng)脫水后再用。 ： 5％次氯酸鈉溶液，取 100克漂粉精，加入 500 毫升水，攪勻，另溶解 70 克碳酸鈉（ Na2Co H2O）于 500 毫升溫水中，溶后，倒入上述溶液中攪勻、澄清、過濾、備用。（每次記錄用量、余量，以備復(fù)查）。 ③稀釋液Ⅱ（ 微克 /毫升）取稀釋液 1 毫升以苯乙腈混合液稀釋。稱取經(jīng)過粉碎（ 20 目篩）的樣品 20克于 250 毫升具塞三角燒瓶中，加正已烷 30 毫升，甲醇水（ 55∶ 45） 100 毫升，加塞后加水少許，蓋嚴(yán)防漏，振蕩 30 分鐘，靜置片刻，以脫脂棉過濾于分液漏斗中，待分層，放出下層的甲醇水溶液 20 毫升（相當(dāng)于樣品 4克）于另一分漏斗中，加氯仿 20 毫升，振搖二分鐘，靜止分層。將分層后 的氯仿放入已備好的具有無水硫酸鈉的漏斗中，過濾，再加 5 毫升氯仿于分液漏斗中，分層后一并濾于同一蒸發(fā)皿中，最后用少量氯仿洗滌濾器，洗液并入以上蒸發(fā)皿中。用帶橡皮頭的滴管的尖端將殘?jiān)浞只旌希粲薪Y(jié)晶析出（苯），將蒸發(fā)皿從水浴上取下，繼續(xù)溶解，混合，晶體消失，再用此管吸取上清液，轉(zhuǎn)移于 2 毫升樣液瓶中，若溶液不夠澄清，應(yīng)離心，或放置等候澄清，取上清液供薄層點(diǎn)板用。 含油脂較多的樣品如花生等也可采用脫油提取，即稱取粉碎樣品 20 克移于濾紙筒內(nèi)，筒內(nèi)塞以少量脫脂棉，置于 250 毫升脂肪提取器內(nèi)，在 75－ 85℃水浴上以石油醚提取脫油 8 小時(shí)，然后將濾紙筒揮干。 如樣品是玉米、大米、小麥時(shí)亦可采用下法提?。悍Q取粉碎過篩樣品 20 克于 250 毫升具塞三角燒瓶內(nèi)，用滴管滴加 6 毫升水，使樣品濕潤，并準(zhǔn)確加入氯仿 60毫升，振蕩 30 分，加無水硫酸鈉 12 克，振搖靜止 30分；以脫脂棉過濾取濾液 12 毫升（相當(dāng)于樣品 4 克）于蒸發(fā)皿，以下步驟與①同。 稱取樣品 4 克于小燒杯中，用正