【正文】 往采用 “ 混合固定液 ” ，應(yīng)用兩種或兩種以上性質(zhì)各不相同的，按適合比例混合的固定液，使分離有比較滿意的選擇性，又不致使分析時間延長。 （十六）混合固定液的處理方法 混合固定液的處理方法有三種： １、分別涂漬于擔體后再混合； ２、將固定液混合后再涂漬，注意這時所用的固定液都應(yīng)溶解在同一個溶劑里； ３、分別涂漬，分別填裝入按比例長短的色譜柱，最后再將它們串接起來。 （十七）常用的固定液涂量 由于固定液含量對分離效率的影響很大。液體比例再大，則被分析的樣品在比較厚的液膜上有擴散現(xiàn)象，有損于分離；液體比例太低時，則由于液膜太薄，擔體表面上殘余的吸附能力會顯示出來，使色譜峰拖尾。對硅藻土擔體固定液含量可大些１５－３０％；由于氟擔體 表面積較小，所以最多只能１０％；至于玻璃微球由于表面積特小，固定液含量便只能保持在０、２５％左右。選用的原則是 １、溶解性好， ２、不與固定液起化學(xué)反應(yīng)， ３、沸點低， ４、毒性小。 （廿十）色譜柱的常用填充方法 固定相填充的好壞，將直接影響柱效率 .通常多用泵抽填充法，即把色譜柱的一端塞上玻璃棉，接真空泵，另一端接一漏斗，在抽吸下加入固定相，邊裝邊敲打色譜柱，至固定相不再進入為止。裝柱要求要填充得均勻，緊密，切忌有空隙。老化的目的是把固定相的殘存溶劑，低沸點雜質(zhì)，低分子量固定液等趕走，使記錄器基線平直，并在老化溫度下使固定液在擔體表面有一個再分布過程，從而涂得更加均勻牢固。 六 氣相色譜儀器的使用注意、維修和保養(yǎng) 儀器選擇的實驗室其室溫宜在（ 10~35） ℃ ,相對濕度 85%，室內(nèi)無腐蝕性氣體和強磁場，有排氣裝置、氫氣報警器和去濕設(shè)備，最好有單獨的穩(wěn)壓電源開關(guān)。 七 應(yīng)用實例 食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定 1 原理 試樣中六六六、滴滴涕經(jīng)提取，凈化后用氣相色譜法測定，與標準比較定量。不同異構(gòu)體和代謝無可同時分別測定。 丙酮 正乙烷 石油醚沸程 30oC60oC。 農(nóng)藥混和標準工作液：分別量取上述各標準儲備液于同一容量瓶中，以正乙烷稀釋至刻度。 提取 稱取具有代表性的 各類食品試樣勻漿 20g，加水5mL（視其水分含量加水，使其總水量約 20mL），加丙酮 40mL，振蕩 30min，加氯化鈉 6g，搖勻。取上清夜 35mL 經(jīng)無水硫酸鈉脫水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，以石油醚定容至 5mL，加濃硫酸 凈化，振搖 ，于3000r/min 離心 15min。 稱取具有代表性的 2g 粉末試樣，加石油醚 20mL，振蕩 30min，過濾，濃縮，定容至 5mL 加濃硫酸 凈化，振搖 ，于 3000r/min 離心 15min。 稱取具有代表性的食用油試樣 ，以石油醚溶解于 10mL 刻度管中，定容至刻度。取上清夜進行 GC 分析。載氣：高純氮，流速 110mL/min；柱溫； 185oC； 檢測器 溫度 225oC；進樣口溫度 195oC。外標法定量。 鑒于液相色譜法在分析中應(yīng)用越來越廣泛，因此每一個分析人員都應(yīng)該掌握液相色譜的基本理論并學(xué)會熟練應(yīng)用液相色譜技術(shù)進行日常檢驗和分析方法研究。又稱為色層法、層析法。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography，以下簡稱 HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于 60 年第二部分 色譜分析 15 代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。又因分析速度快而稱為 高速液 相 色 譜 法 (High Speed Liquid Chromatography ，HSLP)。 二、液相色譜法的特點和優(yōu)點 HPLC 有以下特點： 高壓 —— 壓力可達 150~300 Kg/cm2。 高速 —— 流速為 ~ ml/min。在一根柱中同時分離成份可達 100 種以上。 HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點： 速度快 —— 通常分析一個樣品在 15~30 min，有些樣品甚至在 5 min 內(nèi)即可完成。 靈敏度高 —— 紫外檢測器可達 ，熒光和電化學(xué)檢測器可達 。 樣品量少，容易回收 —— 樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備（制備色譜）。我們已經(jīng)知道，液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)，那么如何來選擇 HPLC方法呢？為 了加深對 HPLC的認識，我們先來看看 HPLC 包含了那些種類。此外還有超臨界流體色譜法 (SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用 CO2），因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。（此外還 有電泳。 下面 我們就按照分離機制的不同對液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法等做一簡單介紹。分離過程是一個 吸附－解吸附 的平衡過程。適用于分離分子量 200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合 物易產(chǎn)生拖尾。 2． 液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學(xué)鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如 C1 C氨基柱、氰基柱和苯基柱。 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。 一般用非極性固定相（如 C1 C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。 RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個 HPLC 應(yīng)用的 80%左右。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的 pH 值。目前有的公司（如安捷倫公司）生產(chǎn)的商品柱可在 pH ~10 范圍內(nèi)操作，但我們在使用時一定要仔細閱讀色譜柱的說明書，嚴格按照要求使 用，以免造成色譜柱的損壞影響其使用壽命。 3． 離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。 pH 值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。 離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。它是根據(jù) 被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。被測組分保 留 時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動 相組成及其 pH 值、離子強度有關(guān)。小分子量的化合物第二部分 色譜分析 17 可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。 分配系數(shù)（ K）：分配色譜中是指溶質(zhì)在固定相中的濃度與溶質(zhì)在流動相中的濃度之比；吸附色譜中是指吸附劑單位表面積或重量所吸附的量與溶質(zhì)在流動相中的濃度之比。 死體積（ VM）：進樣點和檢測點之間所包含的流動相體積，相當于非保留溶質(zhì)的保留體積。 流動相保留時間（ tM）：非保留溶質(zhì)的保留時間。 流量（ F）：單位時間內(nèi)通過色譜柱的流動相體積。 二、液相色譜熱力學(xué)基礎(chǔ) 混和物中不同組分在兩相間平衡分配的差異是色譜法作為一種分離技術(shù)的依據(jù)。因此，某一組分在兩相間的分配有利于固定相時，該組分在色譜柱中逗留的時間就長。正是組分之間平衡分配性質(zhì)的不同使得色譜分離成為可能。 溶質(zhì)通過色譜柱的速度或保留值的大小取決于溶質(zhì)在兩相間分配的熱力學(xué)性質(zhì)，是由每一瞬間該溶質(zhì)在流動相中的分子分數(shù)所決定的。容量因子 k＇大的溶質(zhì)，其分子大部分留在固定相中，因而通過色譜柱的速度低，保留值較大。由于流速可以通過柱長 L 與流動相的保留時間 tM 的比值求得，我們可以將式（ 3－ 1）改寫為： tR － tM k＝ （ 3－ 2） tM 由此我們可以通過某溶質(zhì)峰的保留時間與非保留溶質(zhì)峰的保留時間來計算溶質(zhì)的容量因子 k＇。 我們 知道，有兩個因素決定色譜峰相互重疊的程度：峰尖的間距和峰寬。因此我們對峰的分離第二部分 色譜分析 18 度作如下定義： 相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。 式中 α是分離因子，其定義為兩種溶質(zhì)相對保留值之比，從本質(zhì)上講，α代表了溶質(zhì)之間平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異。塔板理論是 Martin 和 Synger 首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。塔板理論的基本假設(shè)為： 1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達到分配平衡。 3） 流動相在色譜柱內(nèi)間歇式流動，每次進入一個塔板體積。 從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：① 增加塔板數(shù)。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。當 α＝ 1 時， R＝ 0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。 ③ 改變?nèi)萘恳蜃印?k2趨于 0 時， R 也趨于 0； k2 增大， R 也增大。一般 k2 在 1~10 范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學(xué)因素對峰展寬（即柱效）的影響。 2．影響柱效的因素 ① 渦流擴散（ eddy diffusion）。渦流擴散項 A＝ 2λdp， dp 為填料直徑， λ 為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻 λ 越大。但粒度太小難于填充均勻（ λ 大），且會使柱壓過高?？偟恼f來，應(yīng)采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。 ② 分子擴散（ molecular diffusion）。由于進樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴散而引起的峰展寬。 u 為流動相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時間越長（ u ?。?，展寬越嚴重。 Dm 為分子在流動相中的擴散系數(shù)，由于液相的 Dm 很小，通常僅為氣相的 104~105，因此在 HPLC 中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。 γ一般在 ~ 左右，毛細管柱的 γ＝ 1。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜態(tài)流動相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項 Cu 又分為三項。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。 Hsm＝ Csmd2pu/Dm， Csm為常數(shù)。 Hsm 對峰展寬的影響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。所以改進固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動相。 Hs＝ Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs 為常數(shù)， df 為固定液的液膜厚度， Ds 為分子在固定液中的擴散系數(shù)。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中， Hs 才有明顯影響。 從速率方 程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施： 。 。 流速。一般在液相色譜中， uopt 很?。ù蠹s~），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在 1mm/s 的條件下操作。 3．柱外效應(yīng) 速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即 柱外效應(yīng) （色譜峰在柱外死空間里的擴展效應(yīng)）。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。 柱外效應(yīng)的直觀標志是容量因子 k 小的組分（如 k＜ 2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯； k 大的組分影響不顯著。而在經(jīng)典 LC 中則影響相對較小。后來的高壓泵精度很高并可編程進行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波 長到可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器直至可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。 目前常見的 HPLC 儀生產(chǎn)廠家國外有 Waters 公司、Agilent 公司（原 HP 公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。 一、輸液泵 1．泵的構(gòu)造和性能 輸液泵是 HPLC 系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵應(yīng)具備如下性能： ① 流量穩(wěn)定，其 RSD 應(yīng)＜ %，這對定性定量的準確性至關(guān)重要； ② 流量范圍寬，分析型應(yīng)在 ~10 ml/min 范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達到 100 ml/min； ③輸出壓力高，一般應(yīng)能達到150~300 kg/cm2； ④ 液缸容積小； ⑤ 密封性能好，耐腐