【正文】 漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）， 10%BSA封閉 1小時（濕盒中），一抗 4℃ 過夜（分別為 NeuN， 1:200； Beclin1， 1:500）， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍），二抗（ 488標(biāo)記羊抗兔， 1:500； cy3標(biāo)記 羊抗鼠， 1:500）， 37℃ 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 1小時（避光）， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）， DAPI （ 1:1000） 染色 5分鐘， PBS漂洗（ 5分鐘 Χ3遍）。加入二抗之后的步驟避光。甘油封 片，樣品在激光共聚焦顯微鏡下掃描，光源分別用 488 nm 和 561 nm波長的激光器激 發(fā)綠色和紅色熒光，掃描分辨率為 1024 Χ1024 pixel，計算機(jī)數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。 9. 統(tǒng)計分析方法及數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)結(jié)果以 177。S 表示，采用 Graph Pad Instat 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，任意 2 組間比較用成組 t 檢驗，以 P 有統(tǒng)計學(xué)差異， P 有顯著差異。 15 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 0 驗 結(jié) 果 1. 小鼠短暫性局灶性腦缺血再灌注模型的鑒定 實驗動物 tMCAO模型成功即可表現(xiàn)為左側(cè)眼球顏色轉(zhuǎn)白，瞳孔散大，右側(cè)肢 體活動減少或喪失，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，再灌注后眼球顏色立即恢復(fù)紅色，瞳孔 回縮， 12小時后上述肢體活動逐漸恢復(fù)。假手術(shù)組無上述變化。術(shù)后麻醉清醒， 按照神經(jīng)功能缺失的 5分法評分標(biāo)準(zhǔn) [17]于小鼠麻醉清醒后和術(shù)后 24小時進(jìn)行評分 來判斷缺血模型的可靠性。 0分：小鼠正常運動，無神經(jīng)缺損癥狀； 1分：提尾時右 前肢內(nèi)收 ，不能完全伸直； 2分：行走向偏癱傾倒； 3分：向偏癱旋轉(zhuǎn)； 4分：不能 獨立行走或者昏迷； 5分：死亡。 1分 4分者納入標(biāo)準(zhǔn)。（如圖 6所示） 圖 6 tMCAO 24 小 時 的小鼠 Figure 6 mouse in 24h of tMCAO 2．小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的 LC3I、 LC3II 蛋白表達(dá) 變化 實驗動物分為假手術(shù)組和缺血再灌注組。局部腦缺血 60 分鐘后，再灌注 1 小 時、 3 小時、 6 小時、 12 小時、 24 小時。 利用 Western blot 方法檢測左側(cè)大腦皮質(zhì) 和紋狀體的自噬標(biāo)志蛋白 LC3I、 LC3II 的表達(dá)情況（如圖 7 所示）。如前言所述， 細(xì)胞中新合成的 LC3 經(jīng)過加工，成為胞漿可溶性 LC3I，后者經(jīng)泛素樣加工修飾過 16 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 程，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（ PE）結(jié)合，稱為 LC3II。 LC3II 的數(shù)量與自 噬體的數(shù)量成正相關(guān)，在某種程度上可反映了細(xì)胞的自噬活性。在免疫印記試驗中， LC3II 較 LC3I 更加敏感一些，故本實驗以 LC3II/ LC3I 的比值作為統(tǒng)計量。通過分 析本次實驗數(shù)據(jù)，得到假手術(shù)組和缺血再灌注組的皮質(zhì)與紋狀體 LC3II/ LC3 的統(tǒng)計 結(jié)果（如表 1 和圖 8 所示）。與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注后 6 小時后大腦皮質(zhì) LC3II/ LC3I 的表達(dá)開始上調(diào) ， 雖然有所上升但無統(tǒng)計學(xué)差異（ P ）， 12 小時達(dá) 到高峰并有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（ P）；腦缺血再灌注 6 小時后紋狀體 LC3 II/ LC3I 的表達(dá)開始高并有統(tǒng)計學(xué)差異（ P ），腦缺血再灌注后 12 小時、 24 小時仍呈 上 升趨勢 (如圖 8 所示 )。 LC3I、 LC3II 蛋白表達(dá)上調(diào)表明腦缺血再灌注損傷后大腦皮 質(zhì)和紋狀體的自噬活性升高。 圖 7 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 LC3 I、 LC3 II 的 Western blot 結(jié) 果。本 實驗 以 LC3II/ LC3I 的比 值 作 為統(tǒng)計 量，β actin 對計 算 結(jié) 果無影響，故未列出。 （ sham：假手 術(shù)組 。 Ischemia/Reperfusion：缺血再灌注） Figure 7 The Western blot oute of LC3 I、 LC3 II in cortex and striatum . In this experiment, LC3II / LC3I ratio as a statistic, βactin had no effect on the results,which is not listed. 表 1 各 組 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 LC3 II/ LC3 I 表達(dá)水平的比 較 （ 177。 S） 17 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 Table 1 Comparison of LC3 II/ LC3 I in cortex and striatum in mice groups （ 177。S ） 假手術(shù)組 腦缺血再灌組（ Ischemia/Reperfusion） 部位 (sham) 1h 3h 6h 12h 24h 皮質(zhì) 177。 177。 177。 177。 177。** 177。** cortex 紋狀體 177。 177。 177。 177。* 177。** 177。** striatum 圖 8 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 LC3 II/ LC3 I 的 變 化 趨勢 。 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 6h 與 sham 比 較 ： P ，無 統(tǒng)計 學(xué)差異 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 12h 與 sham 比 較 ： P ，有 顯 著的 統(tǒng)計 學(xué)意 義 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion 6h 與 sham 比 較 ： P ，有 統(tǒng)計 學(xué)差異 （ Cortex：大 腦 皮 質(zhì) ； Striatum： 紋 狀體。 * P ， ** P ） Figure 8 The trend of LC3 II/ LC3 I in cortex and striatum Compare Ischemia/Reperfusion 6h tosham in Cortex: P , No significant difference Compare Ischemia/Reperfusion 12h to sham in Cortex: P , Significant statistical significance Compare Ischemia/Reperfusion 6h tosham in Striatum: P , statistical significance 18 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 3．小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的 Beclin 1 蛋白表達(dá)變化 用上述同樣方法觀察缺血再灌注后 1 小時、 3 小時、 6 小時、 12 小時、 24 小時 Beclin 1 的蛋白表達(dá)趨勢（如圖 9 所示）。哺乳動物 Beclin 1 是酵母 Apg6/Vps30 基 因的同源物，是自噬調(diào)控的重要基因，參與自噬體的形成及調(diào)節(jié)其他自噬蛋白在自 噬前體膜的定位。 β actin 即 ― 肌動蛋白 ‖ ，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。由于 β actin 在組織和細(xì)胞中表達(dá)相對恒定，蛋白水平通常不會發(fā)生改變，因此被廣泛用于 Western 時上樣量是否一致，是 Western Blot 很好的內(nèi)參指數(shù)。所以本次實驗借 助 Western blot 方法檢測 Beclin 1 和 β actin 的表達(dá)水平，以 Beclin 1/ β actin 的比值 作為統(tǒng)計量，可對細(xì)胞的自噬活性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和判斷。通過分析本次實驗數(shù)據(jù)， 得到假手術(shù)組和缺血再灌注組的皮質(zhì)與紋狀體 Beclin 1/ β actin 的統(tǒng)計結(jié)果（如表 2 和圖 10 所示）。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注 1 小時皮質(zhì) Beclin 1/ β actin 表達(dá)水平 升高但無統(tǒng)計學(xué)差異（ P ），再灌注 3 小時達(dá)到最高峰并有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 （ P ），再灌注 6 小時后 Beclin 1/ β actin 活性逐漸下降；缺血再灌注 1 小 時紋 狀體 Beclin 1/ β actin 升高有統(tǒng)計學(xué)差異（ P ）， 3 小時達(dá)最高峰有顯著統(tǒng)計學(xué) 差異（ P ），再灌注 12 小時后 Beclin 1/ β actin 表達(dá)逐漸下降并有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ）（如圖 10 所示）。在本次實驗中觀察到 Beclin 1 蛋白的表達(dá)變化表明腦缺血 再灌注損傷后在大腦皮質(zhì)和紋狀體有自噬的激活并伴有活性升高。 圖 9 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 Beclin 1 的 Western blot 表達(dá) 結(jié) 果。本 實驗 以 Beclin 1/ βactin 的比 值 作 為統(tǒng)計 量 進(jìn) 行 統(tǒng)計 分析。 （ sham：假手 術(shù)組 。 Ischemia/Reperfusion：缺血再灌注） 19 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 Figure 9 The Western blot oute of Beclin 1 in cortex and striatum . In this experiment, the ratio of Beclin 1/ βactin as a statistic 表 2 各 組 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 Beclin 1/ β actin 表達(dá)水平的比 較 （ 177。 S） Table 2 Comparison of Beclin 1/ βactin in cortex and striatum in mice groups （ 177。S ） 假手術(shù)組 腦缺血再灌組（ Ischemia/Reperfusion） 部位 (sham) 1h 3h 6h 12h 24h 皮質(zhì) 177。 177。 177。** 177。 177。 177。 cortex 紋狀體 177。 177。* 177。** 177。 177。* 177。 striatum 圖 10 小鼠缺血 側(cè) 皮 質(zhì) 和 紋 狀體 Beclin 1/ β actin 變 化 趨勢 。 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 1h 與 sham 比 較 ： P ，無 統(tǒng)計 學(xué)差異 小鼠 Cortex 側(cè) Ischemia/Reperfusion 3h 與 sham 比 較 ： P ，有 顯 著的 統(tǒng)計 學(xué)意 義 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion 1h 與 sham 比 較 ： P ，有 統(tǒng)計 學(xué)差異 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion 3h 與 sham 比 較 ： P ，有 顯 著的 統(tǒng)計 學(xué)意 義 小鼠 Striatum 側(cè) Ischemia/Reperfusion12h 與 sham 比 較 ： P ，有 統(tǒng)計 學(xué)差異 （ Cortex：大 腦 皮 質(zhì) ； Striatum： 紋 狀體。 * P ， ** P ） 20 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 Figure 10 The trend of Beclin 1/ βactin in cortex and striatum Compare Ischemia/Reperfusion 1h to sham in Cortex: P , No significant difference Compare Isc