【正文】 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2022 級碩士研究生學(xué)位論文 腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激對自噬調(diào)控機制的研究 導(dǎo) 師 姓 名：卞留貫 教授 研究生 姓 名：王文靜 學(xué) 號： 1087209099 專 業(yè)：神經(jīng)外科學(xué) 答 辯 時 間： 2022 年 5 月 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2022 級碩士研究生學(xué)位論文 腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激對自噬調(diào)控機制的研究 導(dǎo) 師 姓 名：卞留貫 教授 研究生 姓 名：王文靜 學(xué) 號： 1087209099 專 業(yè)：神經(jīng)外科學(xué) 0 究 方 向：腦缺血再灌注損傷 0 鍵 詞：腦缺血再灌注；自噬；氧化應(yīng)激； Beclin1； LC3； NAC 申請學(xué)位級別：碩士 0 辯 時 間： 2022 年 5 月 0 養(yǎng) 單 位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 基 金 資 助：上海市科委重點課題資助項目 （項目編號： 09JC1409700。10JC1410700） 上海市科委生物醫(yī)藥重點課題資助項目 （項目編號： 10411954200） 上海交通大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是 本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行 研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含 任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出 重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到 本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 日期： 年 月 日 上海交通大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué) 校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允 許論文 被查閱和借閱。本人授權(quán)上海交通大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分 內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段 保存和匯編本學(xué)位論文。 保密 □，在 年解密后適用本授權(quán)書。 本學(xué)位論文屬于 不保密 □。 （請在以上方框內(nèi)打 ―√‖） 學(xué)位論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激對自噬調(diào)控機制的研究 0 要 目的 探 討缺血再灌注損傷后早期自噬激活的作用機制及氧化應(yīng) 激 對 早 期 自 噬 變 化 的 調(diào) 控 ， 探 討 抗 氧 化 劑 N 乙 酰 L 半 胱 氨 酸 （ NacetylLcysteine， NAC）和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素 (Rapamycin)在缺 血性腦血管疾病方面的應(yīng)用價值，為缺血性腦血管疾病新的藥物治療提 供理論依據(jù)。 方法 采用線栓法制作小鼠短暫性大腦中動脈閉塞 (temporary middle cerebral artery occlusion， tMCAO)模型。實驗分為假 手術(shù)組 (sham 組 )、缺血再灌注組（ ischemia/reperfusion， I/R組）。后者隨機分 tMCAO+ 生理鹽水、 tMCAO+rapamycin和 tMCAO+NAC。 tMCAO+rapamycin組于 術(shù)前 20分鐘側(cè)腦室立體定向注射 rapamycin， tMCAO+NAC組于腦缺血術(shù) 后立刻腹腔注射 NAC， tMCAO組于腦缺血術(shù)后立刻腹腔注射同容積生理 鹽水。在腦缺血 60分鐘后，分別再灌注 1小時， 3小時， 6小時， 12小時， 24小時， Western blot檢測缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體自噬相 關(guān)蛋白 LC3 I、LC3 II和 Beclin 1的表達。利用雙氫溴乙啶 (Dihydroethidium， DHE)染色檢測細 胞內(nèi) ROS水平及對自噬活性的影響，借助熒光顯微鏡觀察 NAC或雷帕霉 素 (Rapamycin)條件下的自噬變化。 NAC和 Rapamycin分別干預(yù)缺血再灌 I 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 注 24小時小鼠，腦片 2,3,5氯化三苯四氮唑 (2,3,5triphenyltetrazolium chloride， TTC)染色觀察腦梗塞面積。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較， 缺血再灌注損傷后 1小時 Beclin 1開始升高， 6小時 LC3 II/ LC3 I開始升高。與對照組相比， NAC干預(yù)后 LC3 II/ LC3 I 和 Beclin 1表達趨勢明顯升高。 DHE染色結(jié)果顯示缺血再灌注損傷 1小時 后即開始出現(xiàn) ROS活性增高，經(jīng) NAC處理后可被部分抑制。 TTC染色提 示 NAC或 rapamycin處理后可減小梗塞面積。 結(jié)論 本結(jié)果提示小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬表達上調(diào) 可能是一種保護機制，氧化應(yīng)激的激活與自噬表達相互影響，抗氧化劑 或自噬誘導(dǎo)劑可以通過激活細胞的自 噬途徑保護神經(jīng)細胞，減小腦梗塞 面積，減輕缺血神經(jīng)元的損傷。 關(guān)鍵詞 ： 缺血再灌注損傷，氧化應(yīng)激，自噬， LC3， Beclin 1， NAC II 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 THE REGULATION OF OXIDATIVE STREE ON AUTOPHAGY AFTER CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION INJURY ABSTRACT Objective To discuss the activation of autophagy and changes of earlyphase autophagy in which the mechanisms of reactive oxygen species(ROS) involved. Discover the Antioxidant Nacetyl Lcysteine (NAC) or the autophagy inducer rapamycin in ischemic cerebrovascular disease of the application. Methods The temporary focal cerebral ischemia was induced by occlusion of the left middle cerebral artery by applying a modified intraluminal filament technique. Animals were divided into sham group and ischemia/reperfusion group (ischemia / reperfusion, I / R) (+ saline), the latter divided into temporary middle cerebral artery occlusion (tMCAO) group, tMCAO + NAC group and tMCAO + rapamycin group randomly. tMCAO + NAC group was treated by intraperitoneal injection of NAC after MCAO, then rapamycin was injected intracerebroventricular 20 min before MCAO. After 60 minutes in focal cerebral ischemia, the reperfusion was performed at 1, 3, 6, 12 and 24 h. The expression of LC3 I, LC3 II and Beclin 1 in the cortex and striatum after ischemiareperfusion were determined by immunoblotting analysis at each time point. The level of ROS was detected by staining technique with dihydroethidium (DHE). Effects of antioxidant NacetylLcysteine (NAC) or rapamycin on antophagy were evaluated using fluorescence microscope. The total infarct volume of slices was determined by 2,3,5triphenyltetrazolium chloride(TTC) staining after 24h reperfusion III 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 under the conditions of focal cerebral ischemia and durg adminstration Results Compared with the shamoperated group, the expression of Beclin1 and LC3 II/ LC3 I was increased at the point of 1h and 6h after focal ischemia reperfusion respectively, while upregulation treated by NAC. The results of DHE staining were that the level of ROS enhanced at 1h after focal ischemia reperfusion, while down regulated after received injections of NAC. According to TTC staining, the treatment with NAC or rapamycin prevented the expansion of the infarct. Conclusion The degree of autophagy and ROS were upregulated after focal ischemiareperfusion injury, which may be a kind of protection. Mutual influence happended between activation of oxidative stress and autophagy. Antioxidants or rapamycin possibly increased the expression of autophagy to protect neurons and attenuated ischemic neuron injury. KEY WORDS reperfusion injury, oxidative stress, autophagy, LC3,Beclin 1,NAC IV 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 目 錄 中文摘要 ....................................................................................................................... Ⅰ 英文摘要 ....................................................................................................................... Ⅲ 縮略語表 ....................................................................................................................... Ⅵ