【正文】 論文正文 第一部分 : 腦缺血再灌注損傷后自噬相關(guān)蛋白的表達及調(diào)控機制 引言 ........................................................................................................................... 1 材 料與方法 ............................................................................................................... 7 實驗結(jié)果 ................................................................................................................. 16 討論 ......................................................................................................................... 23 參考文獻 ................................................................................................................. 28 第二部分：局部腦缺血再灌注損傷后 ROS激活及對自噬調(diào)控 引言 ......................................................................................................................... 31 材料與方法 ............................................................................................................. 36 實驗結(jié)果 ................................................................................................................. 40 討論 ......................................................................................................................... 53 參考文獻 ................................................................................................................. 57 附錄 ............................................................................................................................. 60 致謝 .............................................................................................................................71 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄 ......................................................................... 72 V 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 縮略語表 縮略詞 英文全稱 中文全稱 AMPK 539。AMPactivated protein kinase 539。AMP 激 活 性蛋白激酶 ATG Autophagyrelated gene 自 噬 相 關(guān) 基 因 3MA 3methyladenine 三 甲 基 腺 嘌 呤 BH Bcl2 homology Bcl2 同源結(jié) 構(gòu)域 BSA Bovine serum albumin 牛 血 清 白 蛋 白 CMA Chaperonemediated autophagy 分 子 伴 侶 介 導(dǎo)的自噬 CNS Central nerve system 中 樞 神 經(jīng) 系 統(tǒng) DHE Dihydroethidium 雙氫溴乙啶 DTT Dithiothreitol 二硫蘇糖醇 EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid,disodium 乙 二 胺 四 乙 酸二鈉 EGTA Ethyleneglycolbis(βaminoethyl)N,N, 乙 二 醇 雙 (2 N’,N’tetraacetic acid 氨 基 乙 基 ) 四 乙酸 HEPES N2hydroxyethylpiperazineN’2ethanesulfonic N2 羥 乙 基 acid 哌 嗪 N’2 乙 磺酸 HNE 4hydroxy2nonenal 4 羥 基 2 丙 烯醛 JNK CJun Nterminal kinase cJun 氨基端 激酶 LC3 Microtubuleassociated protein1 light chain3 微 管 相 關(guān) 蛋 白輕鏈 3 MAPK Mitogenactivated protein kinase 絲 裂 原 活 化 蛋白激酶 NAC Nacetylcysteine N 乙 酰 L 半 胱氨酸 . Optical density 光密度 VI 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚 丙 烯 酰 胺 凝膠電泳 PBS Phosphate buffered saline 磷 酸 鹽 緩 沖 液 PCD Programmed Cell Death 程 序 性 細(xì) 胞 死亡 PI3K Class III phosphatidylinositol 3kinase Ⅲ 型 磷 脂 酰 肌 醇 三 磷 酸 激酶 PMSF Phenylmethyl sulfony1 fluoride 苯 甲 基 磺 酰 氟 PNPP Pnitrophenyl phosphate 對 硝 基 苯 磷 酸 PVDF Polyvinylidene difluoride 聚 偏 二 氟 乙 烯膜 ROS Reactive oxygen species 活性氧 SDS Sodium dodecyl sulfate 十 二 烷 基 硫 酸鈉 TEMED N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine 四 乙 基 乙 二 胺 tMCAO Temporary middle cerebral artery occlusion 短 暫 性 大 腦 中動脈閉塞 TOR kinase Target of rapamycin kinase 雷 帕 霉 素 靶 點激酶 TBI Traumatic Brain Injury 創(chuàng) 傷 性 腦 損 傷 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane 三 (羥甲基 )氨 基甲烷 TTC 2,3,5Triphenyltetrazolium chloride 2， 3， 5氯化 三苯四氮唑 Tween20 Tween20 吐溫 20 VII 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分： 腦缺血再灌注損傷后自噬相關(guān)蛋白的表達及 調(diào)控機制 引 言 腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病和多發(fā)病，是人類嚴(yán)重病殘和死亡的重要原 因之一，其中又以缺血性腦血管疾病的發(fā)病率居首位。流行病學(xué)調(diào)查顯示缺血性腦 卒中的發(fā)病率大約為 ‰ ～ 4‰ ，死亡率為 3‰ 。嚴(yán)重的后遺癥及很高的死亡率一 直困擾著醫(yī)療界，多年來缺乏新型的有效治療藥物。自噬作為存在于真核細(xì)胞內(nèi)的 一種溶酶體依賴 性的胞內(nèi)降解途徑，與神經(jīng)元存活 /死亡密切相關(guān)，其在腦缺血再 灌注損傷過程中參與的復(fù)雜調(diào)控機制已經(jīng)成為目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的重點之一。 1. 自噬 自噬的概念 腦缺血可以引起大腦神經(jīng)元不可逆性損傷和死亡。在細(xì)胞死亡的過程中，可能 發(fā)生凋亡性程序性細(xì)胞死亡（ Apoptosis），自噬性程序性細(xì)胞死亡 (Autophagy)和細(xì) 胞壞死（ Nercrosis）三種類型 [1]。凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，染色質(zhì) 邊集，核 DNA 降解，殘余的細(xì)胞被吞噬細(xì)胞消化，被稱為 Ⅰ 型程序性細(xì)胞死亡。 近年來，另一種新的細(xì)胞死亡方式 —自噬性程序性細(xì)胞死亡吸引了科學(xué)家們的關(guān)注 被稱為 II 型程序性細(xì)胞死亡。通過電鏡可以看到膜狀結(jié)構(gòu)的自噬體和其他亞細(xì)胞 結(jié)構(gòu)以及熒光顯微鏡觀察到點狀聚集物的形成（如圖 1 所示）。自噬這一概念最早 由 Christian de Duve 于 1963 年提出，一份全新的國際性雜志《 Autophagy》已在 2022 年 4 月份出版， 2022 年召開第一次自噬國際會議。針對目前自噬檢測缺乏統(tǒng) 一標(biāo)準(zhǔn)的問題，《 Autophagy》雜志在 2022 年第二期，刊登 了主編 Daniel 聯(lián)合世 界 上 200 多名自噬研究領(lǐng)域?qū)＜易珜懙木C述文章 ― Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes‖ 。目前，自噬繼 凋亡之后已逐漸成為學(xué)科各領(lǐng)域研究的重要發(fā)展方向。 1 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖 1 自噬 電鏡 及 熒 光 顯 微 鏡 的 圖 片 Figure 1 Images of electron microscopy and fluorescence microscopy in autophagy 自噬的形成及分類 自噬的形成過程 自噬首先通過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形 成杯狀分隔膜，包繞在被降解胞質(zhì)內(nèi)容物周圍，分隔膜逐延伸，將要被降解的胞漿 成分完全包繞形成自噬體 (autophagosome)，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并 借助于蛋白水解酶降解其內(nèi)成分，之后自噬體膜脫落再循環(huán) 利用 [2] (如圖 2 所示 )。 圖 2 自噬體的形成 過 程 Nat Rev Drug Discov 2022, 6: 304312 Figure 2 The formation process of autophagosome Nat Rev Drug Discov 2022, 6:304312 2 上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 自噬的分類 根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運送到溶酶體內(nèi)的途徑不同，已確定自噬主要有 3種形式：大自噬、 小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬 [3]。 大自噬 (Macroautophagy)，又稱巨自噬，即我們通常所指的自噬，是非溶酶體來 源的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞漿內(nèi)容物和變性壞死的細(xì)胞器形成自噬體，接著是在細(xì)胞骨 架蛋白驅(qū)動下自噬體與溶酶體的融合，形成自噬溶酶體，溶酶體利用自身的蛋白水 解酶降解自噬體內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)。大自噬通常在外界環(huán)境壓力或者內(nèi)環(huán)境變化刺激下激 活，一方面利用降解成的核苷、氨基酸和脂肪酸合成新的大分子和 ATP，維