【正文】 敷前觀察及記錄紅斑、水腫、色素沉著、出血點、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況及其發(fā)生時間及消退時間，并對紅斑及水腫進行評分。末次貼敷后，在去除藥物后 3060分鐘， 2 48和72小時肉眼觀察并記錄涂敷部位有無紅斑和水腫等情況。持久性和中度以上損傷的觀察同單次給藥。 ④ 結(jié)果評價：單次給藥計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應(yīng)積分平均分值。將受試側(cè)皮膚反應(yīng)平均分值減去賦形劑皮膚平均分值得到原發(fā)性刺激指數(shù)，按表進行刺激強度評價。多次給藥首先計算每一觀察時間點各組原發(fā)性刺激積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物刺激積分均值即累積刺激指數(shù)，進行刺激強度評價。 紅斑 水腫 刺激反應(yīng) 分值 刺激反應(yīng) 分值 無紅斑 0 無水腫 0 輕度紅斑（勉強可見） 1 輕度水腫（勉強可見） 1 中度紅斑（明顯可見） 2 中度水腫（明顯隆起） 2 重度紅斑 3 重度水腫（皮膚隆起 1mm，輪廓清楚） 3 紫紅色紅斑到輕度焦痂形成 4 嚴重水腫（皮膚隆起 1mm以上并有擴大） 4 最高總分值 8 皮膚刺激反應(yīng)評分標準 分值 評價 無刺激性 輕度刺激性 中度刺激性 強刺激性 皮膚刺激強度評價標準 4） 試驗報告 符合 GLP實驗室管理規(guī)范，內(nèi)容包括：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量；實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明動物合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境（包括飼料來源、室溫、濕度、照明、實驗動物設(shè)施合格證號）；詳細的試驗操作；每只動物在每一觀察時間點的皮膚反應(yīng)積分；具體描述其它毒性反應(yīng)；試驗結(jié)論等。 5） 試驗結(jié)果的解釋 該試驗系統(tǒng)比人皮膚刺激反應(yīng)敏感，刺激反應(yīng)陰性大多可確定為無刺激性，陽性反應(yīng)要排除假陽性。除非受試物有大范圍或長時間的使用，否則輕度刺激性可不予重視。 4. 注射給藥部位刺激性試驗 炎癥、組織變性和壞死等不良反應(yīng)。 1）試驗方法 試驗動物：家兔，每組（單次給藥、多次給藥）不少于 3只。設(shè)生理鹽水對照，用同體左右側(cè)自身對比。 給藥方法：途徑與臨床使用情況一致，可選用耳緣靜脈，耳中心動脈、股和背部肌肉，側(cè)胸壁皮下組織等。給藥容積和速率應(yīng)根據(jù)動物情況進行相應(yīng)的調(diào)整。給藥期限應(yīng)根據(jù)藥物擬用于臨床的情況來決定，多次給藥一般不超過 7天。 動物觀察：單次給藥，在給藥后 4896小時對動物和注射部位進行肉眼觀察；多次給藥，每天給藥前以及最后一次給藥后 4896小時對動物和注射部位進行肉眼觀察。觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進行病理學檢查。留下的動物繼續(xù)觀察 14－21天再進行病理組織學檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。 2）結(jié)果評價：根據(jù)肉眼觀察和病理檢查結(jié)果，對受試物進行安全性評價。 3）試驗報告 試驗報告應(yīng)符合 GLP實驗室管理規(guī)范，內(nèi)容包括：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量；實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明動物合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境（包括飼料來源、室溫、濕度、照明、實驗動物設(shè)施合格證號）；詳細的試驗操作；每只動物在每一觀察時間點的刺激反應(yīng)情況；具體描述其它毒性反應(yīng)；試驗結(jié)論等。 ⒊ 眼刺激性試驗 眼前部表面可逆性組織改變（炎癥、變性和壞死等）。 1）試驗方法 試驗動物 ：首選家兔，動物數(shù)每組不少于 3只。應(yīng)設(shè)置生理鹽水對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。試驗前 24小時內(nèi)對動物進行雙眼檢查（包括熒光素鈉檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結(jié)膜損傷動物棄用。 給藥方法 ：每只眼睛滴入 ，然后合眼瞼約 10s。不需沖洗眼睛。用藥周期根據(jù)擬臨床情況決定，多次給藥一般不超過 4周。 眼部觀察 ：單次給藥，在給藥后 2 48和 72小時對眼部進行檢查；多次給藥，每天給藥前以及最后一次給藥后 2 48和 72小時對眼部進行檢查。如果在 72小時未見任何刺激癥狀，試驗則可結(jié)束。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限。但一般不超過 21天?？墒褂梅糯箸R、裂隙燈、生物顯微鏡和其他器械進行眼刺激反應(yīng)檢查。在記錄了 24h的觀察后，可進一步用熒光素染色檢查。記錄每次檢查眼部反應(yīng)的分值（見表）。觀察部位：結(jié)膜、角膜、虹膜及其他。 2）結(jié)果評價 ：將每一個觀察時間每一動物的眼角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)分值相加得總積分，將一組的積分總和除以動物數(shù)，即得最后分值。 眼刺激反應(yīng)分值標準 角膜 虹膜 結(jié)膜 （瞼結(jié)膜和球結(jié)膜） 充血 水腫 分泌物 眼刺激反應(yīng) 分值 眼刺激反應(yīng) 分值 眼刺激反應(yīng) 分值 眼刺激反應(yīng) 分值 眼刺激反應(yīng) 分值 無混濁 0 正常 0 血管正常 0 無水腫 0 無分泌物 0 散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見 1 皺褶明顯加深、充血 ,腫脹 ,角膜周圍輕度充血 ,瞳孔對光仍有反應(yīng) 1 血管充血呈鮮紅色 1 輕微水腫 (含眼瞼 ) 1 少量分泌物 1 半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清 2 出血 /肉眼可見壞死 /對光無反應(yīng)（或其中一種） 2 血管充血呈深紅色，血管不易分辨 2 明顯水腫伴部分眼瞼外翻 2 分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著 2 出現(xiàn)灰白半透明區(qū) ,虹膜細節(jié)不清 ,瞳孔大小勉強可見 3 彌漫性充血呈紫紅色 3 水腫至眼瞼近半閉合 3 分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著 3 角膜不透明 ,虹膜無法辨認 4 水腫至眼瞼超過半閉合 4 最大總積分 16 眼 刺 激 性 評 價 標 準 分值 評價 03 無刺激性 48 輕度刺激性 912 中度刺激性 1316 強度刺激性 3）試驗報告 內(nèi)容包括：同上，每只動物在每一觀察時間點的眼睛反應(yīng)分值；具體描述毒性反應(yīng)；試驗結(jié)論等。 4）試驗結(jié)果的解釋 該試驗系統(tǒng)比人眼睛刺激反應(yīng)敏感，刺激反應(yīng)陰性大多可確定為無刺激，陽性反應(yīng)要排除假陽性。除非受試物有大范圍或長時間的使用，否則輕度刺激性可不予重視。 ⒈ 被動皮膚過敏試驗（ PCA） 1）基本原理： 將致敏動物血清（內(nèi)含豐富 IgE抗體）皮內(nèi)注射于正常動物。IgE與皮膚肥大細胞的 Fcз受體結(jié)合，使之被動致敏。當致敏抗原激發(fā)時，引起局部肥大細胞釋放過敏介質(zhì)，從而使局部血管通透性增加，注入染料可滲出于皮丘，形成一個藍斑。根據(jù)藍斑范圍或分光光度計法測定，判定過敏反應(yīng)程度。 2）試驗動物 ： PCA反應(yīng)常用的動物是大鼠，亦用小鼠，有時根據(jù)試驗需要用家兔。因這些動物 PCA反應(yīng)是由 IgE介導(dǎo)的。 3）試驗分組： 應(yīng)設(shè)立陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組。陰性對照組應(yīng)給予同體積的溶媒，陽性對照組給予卵白蛋白或天花粉或已知致敏陽性藥物。每組動物數(shù)至少 4只。 4）致敏： 按臨床擬給藥途徑。隔日致敏一次，共 5次。末次致敏后 10天左右采血， 2022轉(zhuǎn) /分離心 10分鐘，分離血清， 20℃ 保存， 2周內(nèi)備用。 5）激發(fā)： 上述各組抗血清用生理鹽水稀釋成 1: 1: 1:32。在背部脫毛3 4cm2動物皮內(nèi)注射各組的抗血清 。經(jīng) 24或 48小時后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的 %伊文思蘭染料共 1mL。 6）測定及結(jié)果評價： 30分后麻醉處死各組動物，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層的斑點大小，直徑大于 5mm者判定為陽性。 ㈡ 過敏性試驗方法 ⒉ 全身主動過敏試驗（ ASA） 1）基本原理 對致敏動物體內(nèi)靜脈注射抗原，觀察抗原與 IgE抗體結(jié)合后導(dǎo)致肥大細胞、嗜堿性細胞脫顆粒、釋放活性介質(zhì)而致的全身性過敏反應(yīng)。觀察受試物經(jīng)全身給藥后對動物引起的過敏性反應(yīng)。 2）試驗方法 ① 動物 通常選用體重為 300400克的 Hartley種雄性豚鼠。 ② 劑量組別 陰性、陽性對照組，低、高劑量組。每組動物至少 4只。 ③ 致敏 致敏途徑：按臨床給藥途徑；致敏次數(shù)：隔日一次，共 5次；致敏劑量：陰性對照組給予同體積溶解藥物的溶媒；陽性對照組：給予 15mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)；低劑量組給予臨床最大劑量（ /kg或 m2）；高劑量組給予低劑量的數(shù)倍量。 ④ 激發(fā) 激發(fā)途徑：通常靜脈內(nèi)給藥；激發(fā)次數(shù)：末次注射后第 1014日一次激發(fā)；激發(fā)劑量：通常為致敏劑量的 25倍量；觀察指標：致敏期間每日觀察每只動物的癥狀，初次和最后一次致敏和激發(fā)當日測定每組每只動物的體重。靜脈注射后立刻至 30分鐘，按表 5癥狀詳細觀察每只動物的反應(yīng)，癥狀的出現(xiàn)及消失時間。最長應(yīng)觀察 3小時。 0 正常 7 呼吸急促 14 步態(tài)不穩(wěn) 1 不安 8 排尿 15 跳躍 2 立毛 9 排糞 16 喘息 3 發(fā)抖 10 流淚 17 痙攣 4 搔鼻 11 呼吸困難 18 橫轉(zhuǎn) 5 噴嚏 12 羅音 19 潮式呼吸 6 咳嗽 13 紫癜 20 死亡 過敏反應(yīng)癥狀 0 過敏反應(yīng)陰性 14癥狀 + 過敏反應(yīng)弱陽性 110癥狀 ++ 過敏反應(yīng)陽性 119癥狀 +++ 過敏反應(yīng)強陽性 20 ++++ 過敏反應(yīng)極強陽性 全身致敏性評價標準 五、參考文獻 ? 1 .Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and Nonrodent Toxicity Testing). ICHS4A. 1999 ? 2． Nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials for pharmaceuticals. ICHM3. 1997 ? 3． Note for guidance on repeated dose Toxicity. 2022. CMPM /SWP/1042/99, EMEA ? 4．秦伯益 . 新藥評價概論（第二版） . 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1998. 163176 ? 5．袁伯俊，王治喬 . 新藥臨床前安全性評價與實踐 . 北京：軍事醫(yī)學科學出版社， 1997， 4362 ? 6． Principles and Methods of Toxicology, Fourth Edition, edited by Hayes,Tayloramp。 Francis, Philadelphia, 2022