限制性內(nèi)切酶ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-05 20:31本頁(yè)面
【正文】 Ⅰ prefix 和 pⅠ prefix 系列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。 Ⅰ prefix 是由在 RNA 水平上剪切和編碼的， pⅠ prefix 在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。這類內(nèi)切酶也稱為 homing endonuclease ，目前商業(yè)化的種類有 6 種。從因特網(wǎng)上可以找到 Intein 的數(shù)據(jù)庫(kù) Inbase（ Intein Database），該網(wǎng)站由 New England BioLabs 公司維護(hù)（ 。 Ⅰ CeuI 酶是衣滴蟲(chóng)（ Chlamydomonas eugametos）葉綠體大 rRNA 基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識(shí)別位點(diǎn)為 26bp ，識(shí)別的核心部位為 12 至 +7 位置的 19bp 。反應(yīng)溫度為 37℃ ，識(shí)別位點(diǎn)如下，方框內(nèi)為核心識(shí)別序列。 TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響 限制酶切割 DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說(shuō)在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。 用 20 單位（ Units）限制酶切割 1?g 標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求（表 23）。相對(duì)來(lái)說(shuō)， EcoRⅠ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)在 2 小時(shí)的切割活性可達(dá) 90% 。而 AccⅠ 和 HindⅢ 對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較大。 用 DNA 片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。 在設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。 表 23：靠近 DNA片段末端的切割效率 %（用寡核苷酸檢測(cè)） 影響酶活性的因素 影響酶切活性的因素有許多，概略的說(shuō)可分為外因和內(nèi)因。外因是可預(yù)見(jiàn)和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等。內(nèi)因包括位點(diǎn)偏愛(ài)性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時(shí)的活性，如與切割 λDNA 相比， EcoRⅠ 、 PstⅠ 、 SalⅠ 需要至少 倍的酶來(lái)切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRTⅠ 與 XhoⅠ 切割相同的序列（ C↓TCGAG），但如果 539。 端為 CT 則 PaeRTⅠ 不能切割。 Transitional Page Backdrops: These are full sized backdrops, just scale them up! Can be CopyPasted out of Templates for use anywhere! Title Backdrop Slide Backdrop Print Backdrop Additional Graphics: Scale them up or down! .GIF clipart is animated. .JPG clipart can be scaled up and take up little file space. .PNG clipart can be scaled unusually large without distortion. Transitional Backdrop
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