《限制性?xún)?nèi)切酶》ppt課件-文庫(kù)吧
2024-12-21 20:31 本頁(yè)面
【正文】 同源二聚體（ homodimer），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在 DNA 鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中還有一類(lèi)特殊的類(lèi)型，該酶只切割雙鏈 DNA 中的一條鏈，造成一個(gè)切口，這類(lèi)限制酶也稱(chēng)切口酶 （ nicking enzyme），如 NBI 。 Ⅰ 型（ type Ⅰ ）限制與修飾系統(tǒng)的種類(lèi)很少，只占 1% ，能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割 DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專(zhuān)一性，是隨機(jī)的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亞基和 M 亞基） 各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA 序列的 S 亞基，分別由 hsdR、 hsdM 和 hsdS 基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。EcoK 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M2S。 EcoB 編碼基因的結(jié)構(gòu)為 R2M4S2 。 EcoB 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為甲基化位點(diǎn)， N 表示任意堿基。 TGA*（ N） 8TGCT EcoK 酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的 A 為可能的甲基化位點(diǎn)。 AA176。 C（ N） 6GTGC 但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn) 1000bp 以外，且無(wú)特異性。 Ⅲ 型（ type Ⅲ ）限制與修飾系統(tǒng)的種類(lèi)更少，所占比例不到 1% ，也有專(zhuān)一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱(chēng)的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位點(diǎn)則在下游 2426bp 處。 在基因操作中，一般所說(shuō)的限制酶或修飾酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系統(tǒng)中的種類(lèi)。 表 21：各種限制與修飾系統(tǒng)的比較 Ⅱ Ⅰ Ⅲ 酶分子 內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起 三亞基雙功能酶 二亞基雙功能酶 識(shí)別位點(diǎn) 46bp, 大多數(shù)為回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu) 二分非對(duì)稱(chēng) 57bp 非對(duì)稱(chēng) 切割位點(diǎn) 在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn) 無(wú)特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp 在識(shí)別位點(diǎn)下游 2426bp 限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng) 分開(kāi)的反應(yīng) 互斥 同時(shí)競(jìng)爭(zhēng) 限制作用是否需用 ATP No Yes Yes 限制酶識(shí)別的序列 1．限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度 限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為 48 個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為 6 個(gè)堿基（表 22）。當(dāng)識(shí)別序列為 4 個(gè)和 6 個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每 256 個(gè)和 4096 個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（ 4^4=256， 4^6=4096）。以下是幾個(gè)有代表性的種類(lèi)，箭頭指切割位置。 4 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)： Sau3AⅠ ↓GATC 5 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)： EcoRⅡ ↓CCWGG； NciⅠ CC↓SGG 6 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)： EcoRⅠ G↓AATTC； HindⅢ A↓AGCTT 7 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)： BbvCⅠ CC↓TCAGC； PpuMⅠ RG↓GWCCY 8 個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)： NotⅠ
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