【正文】 （四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 1 天然有機(jī)物分子大小各異 分子量從幾十到幾百萬(wàn) 可據(jù)此進(jìn)行分離 2 常用的有 透析法 、 凝膠濾過(guò)法 、 超濾法 、 超速離心法等 3 透析法、超濾法、超速離心 用于分離水溶性大分子 凝膠過(guò)濾法分離較小分子 凝膠濾過(guò)法 (gel filtration) ? 又稱 : 凝膠滲透色譜 (gel permeation chromatography) 分子篩濾過(guò) (molecular sieve filtration) 排阻色譜 (exclusion chromatogrphy) ? 利用分子篩分離物質(zhì)的方法 凝膠柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及性質(zhì)： ? 凝膠的種類及商品較多 ， 一般在水中不溶但可膨脹的球形顆粒 ， 具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。 ? 常用的有葡聚糖凝膠 （ Sephadex G） 類型和羥丙基葡聚糖凝膠 （ Sephadex LH20） 類型 。 葡聚糖凝膠（ Sephadex G） 交聯(lián)度 高 表明加入的交聯(lián)劑 多 ，孔徑 小 則網(wǎng)孔緊密，膨脹時(shí)的吸水量 小 交聯(lián)度 低 表明加入的交聯(lián)劑 少 ，孔徑 大 則網(wǎng)孔稀疏，膨脹時(shí)的吸水量 大 由平均分子量一定的葡聚糖及 交聯(lián)劑（如環(huán)氧氯丙烷）交聯(lián)聚合而成 生成的凝膠顆粒網(wǎng)孔大小 取決于所用交聯(lián)劑的數(shù)量及反應(yīng)條件 并用 交聯(lián)度 表示 OC H2O HO HO HOOC H2O HOO HOOC H2O HO HO HOOOC H2O HO HOC H2C H O HC H2OOO HO HC H2OOC H2O HO HO HOOO C H2C H O H C H2 O交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu) 葡聚糖凝膠商品型號(hào) 按交聯(lián)度大小分類，并用吸水量表示 如 Sephadex G25表示： G（ Gel）， 25＝吸水量（ ） 10。 葡聚糖凝膠只能在水及含醇水中應(yīng)用 根據(jù)不同規(guī)格的孔徑不同選擇應(yīng)用 一般天然藥物分子量在 1001500左右 可選 Sephadex G10， 20， 25 羥丙基葡聚糖凝膠（ Sephadex LH20） ? 為 Sephadex G25經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物 。 ? 葡萄糖部分羥基與羥丙基以醚鍵的形式結(jié)合 ，分子中的碳鏈加長(zhǎng) ， 脂溶性增加 。 ? 即可以在水相中進(jìn)行 ， 又可以在極性的有機(jī)溶劑中進(jìn)行 。 R － O H R － O C H 2 C H 2 C H 2 O H羥 丙 基 化凝膠的分離原理 ? 主要是分子篩作用 ， 分子量大的不能或難以進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部 ， 故在顆粒間隙移動(dòng) ，一般會(huì)隨溶劑先下來(lái)；而分子量小的則可以滲入擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部 ， 通過(guò)色譜柱時(shí)阻力較大 ， 故將較晚流出 ， 不同分子量的分子進(jìn)入到顆粒內(nèi)部的程度不同 ， 所受阻力也不相同 ， 因而流出速度也不同 ， 據(jù)此可將不同分子量的化合物分離 。 ? 亦有反相分配色譜的作用 。 凝膠色譜分離示意圖 凝膠的使用 ? 裝柱與洗脫劑 ：水中濕法裝柱 ， 水溶液濕法上樣 。 ? 預(yù)處理與再生處理： 水洗 含醇水洗 （ 醇濃度逐步加大 ） 醇洗 ? Sephadex LH20比較昂貴 ， 應(yīng)注意再生處理和保存 ！ 膜分離技術(shù) (membrane separation technique) ? 原理 以選擇性透過(guò)膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動(dòng)力時(shí)，原料兩側(cè)組分選擇性地透過(guò)膜，以到達(dá)分離純化的目的。 ? 特點(diǎn) 無(wú)相變；不用有機(jī)溶劑；選擇性高；適用范圍廣。 ? 類型 微濾、超濾、納濾、反滲透 （五）根據(jù)物質(zhì)離解程度的不同進(jìn)行分離 對(duì)于具有酸性、堿性或兩性基團(tuán)的分子 在水中多呈離解狀態(tài)（正離子或負(fù)離子狀態(tài)） 可采用離子交換法或電泳技術(shù) （如高效毛細(xì)管電泳法）進(jìn)行分離 離子交換樹脂是以離子交換樹脂為固定相 依據(jù)流動(dòng)相中組分離子與平衡離子 進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別 而進(jìn)行的一種層析方法 離子交換色譜法（ IEC) 高分子聚合物基質(zhì)： 苯乙烯通過(guò)二乙烯苯（ DVB） 交聯(lián)成的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 電荷基團(tuán)： 與高分子共價(jià)結(jié)合形成 帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán) 平衡離子： 結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子 能與溶液中其他離子團(tuán)可逆交換 ? 平衡離子帶正電的離子交換樹脂能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換，稱 陽(yáng)離子交換樹脂 ；平衡離子帶負(fù)電的離子交換樹脂能與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換，稱 陰離子交換樹脂 。 ? RXY+ + A+ RXA+ + Y+ ? RX+Y + A RX+A + Y 陽(yáng)離子交樹脂：強(qiáng)酸性（－ SO3H+） 弱酸性（－ COOH+）。 陰離子交樹脂：強(qiáng)堿性（－ N(CH3)3Cl） 弱堿性（－ NH2）。 C H C H2C H C H2C H C H2S O3H S O3H S O3HC HC H2C H C H2C HS O3HS O3H離子交換樹脂的結(jié)構(gòu) 分離原理： ? 以離子交換樹脂為固定相，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)交換柱時(shí)，溶劑中的中心分子以及不發(fā)生交換的化合物將首先通過(guò)柱子流出，而被交換的離子被交換吸附到柱子上，利用不同的洗脫劑即可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離。 離子交換樹脂的使用 ? 裝柱與洗脫劑 ： 濕法裝柱上樣（水或含水溶劑）。水或酸堿洗脫劑（如 NaOH水溶液， HCl水溶液等），或酸堿緩沖液（如磷酸鹽緩沖液、氨水緩沖液、吡啶緩沖液等）。 ? 預(yù)處理 在水中溶脹，水懸浮去掉雜質(zhì)；酸堿交換浸泡，水洗至中性， ? 再生處理 陽(yáng)離子交換樹脂：酸洗 堿洗 酸洗 陰離子交換樹脂：堿洗 酸洗 堿洗 離子交換樹脂的應(yīng)用 ? 用于不同電荷的分離： 可以利用離子交換樹脂將混合物分為中性化合物、酸性化合物、堿性化合物和兩性化合物等幾個(gè)部位。 ? 用于相同電荷的分離： 根據(jù)其酸堿性強(qiáng)弱的不同，在樹脂上吸附程度的不同，選用適當(dāng)?shù)南疵搫ɑ蛱荻认疵摚┻M(jìn)行分離。分離電荷相同且離解程度相近的化合物，可選用 200－ 400目的微粒固定相用。 薄層色譜在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用 指導(dǎo)提取工藝的選擇 提取溶劑的選擇 確定提取次數(shù) 萃取劑的選擇 A 指導(dǎo)分離條件的選擇 選擇柱色譜條件 檢查分離的效果 B 天然產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)研究法 純度鑒定 ? 熔點(diǎn)測(cè)定法：純凈的化合物熔點(diǎn)敏銳。 ? TCL或 PCL：需用三種展開系統(tǒng)證明均為一個(gè)斑點(diǎn)。 ? GC：適合于可以氣化的樣品。 ? HPLC：適合所有化合物。 ? GC和 HPLC的優(yōu)點(diǎn)突出，用量少、時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確度高。 鑒定天然產(chǎn)物化學(xué)成分的一般步驟 物理常數(shù)測(cè)定 熔點(diǎn)、比旋度 沸點(diǎn)、折光率比旋光度 結(jié)構(gòu)式確定 平面結(jié)構(gòu) 立體結(jié)構(gòu) 分子骨架 確定 不飽和度 物理常數(shù) 波譜性質(zhì) 化學(xué)反應(yīng) 分子式測(cè)定 元素定性定量分析 MS法求分子量 質(zhì)譜（ MS） ? 以某種方式使樣品分子電離、裂解，然后按質(zhì)荷比（ m/z）大小把生成的各種離子分離，檢測(cè)它們的強(qiáng)度，并按 m/z的大小排列成譜。 ? 可用于確定分子量及求算分子式。 ? 提供其他結(jié)構(gòu)信息，推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。 ? 鑒定是否為同一化合物。 紫外吸收光譜 （ UV） ? 用紫外光為光源（ 200～ 400nm），照射樣品溶液，測(cè)量其吸收度，并用波長(zhǎng)對(duì)吸收度或摩爾吸收系數(shù)作圖而得的吸收光譜圖。 ? 分子結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵、發(fā)色團(tuán)和共軛體系的助色團(tuán)的化合物在紫外光區(qū)產(chǎn)生紫外吸收光譜。 ? 可根據(jù)紫外吸收光譜曲線最大吸收峰的位置基吸收峰的數(shù)目和摩爾吸收系數(shù)來(lái)確定化合物的基本母核，或是確定化合物部分結(jié)構(gòu)。 ? 可用于確定某樣品是否已知化合物；確定未知不飽和化合物的結(jié)構(gòu)骨架；異構(gòu)體的確定 。 紅外吸收光譜 （ IR） ? 采用 ～ 15μm(4000～ 667cm1)范圍內(nèi)的不同波長(zhǎng)的光波為光源，依次照射樣品，經(jīng)自動(dòng)描繪所得的吸收光譜曲線。 ? 其橫坐標(biāo)是波數(shù)或波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是百分透光度。 ? 應(yīng)用紅外光譜測(cè)定分子中的基團(tuán)，是利用各基團(tuán)的特征吸收峰所出現(xiàn)的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和形狀來(lái)判斷的。 核磁共振 (NMR) ? 是有磁矩的原子核 （ 如 1H、 13C） ， 在磁場(chǎng)的作用下 ， 以射頻照射 ， 產(chǎn)生能級(jí)躍遷而獲得的共振信號(hào) 。 ? 1H NMR：提供分子中不同種類氫原子的情報(bào)：H的數(shù)目 ， 不同環(huán)境下 H的化學(xué)位移 ， 偶合常數(shù) ， 從而分析 H相鄰基團(tuán)的結(jié)構(gòu)等 。 位移范圍：0～ 20ppm。 ? 13C NMR：碳譜的主要特點(diǎn)是化學(xué)位移范圍寬達(dá) 300ppm以上 。 ? 二者互為補(bǔ)充 ， 提供化合物結(jié)構(gòu)的許多重要的信息 。 謝 謝 大 家 ！