【正文】 殖；或立即將發(fā)酵液滅菌重新接種； 發(fā)酵后期 染菌，而雜菌又不影響生產(chǎn)菌的正常發(fā)酵，也不妨礙產(chǎn)品后處理，則讓其共生長；如果 雜菌影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或產(chǎn)品的后處理，應(yīng)提前放罐 ；還可以在發(fā)酵液中加入抑制雜菌的物質(zhì)。 91 發(fā)酵前期污染噬菌體 應(yīng)停止攪拌、小通風(fēng)，立即培養(yǎng)抗性菌株，接入發(fā)酵罐，或更換生產(chǎn)菌種；在罐內(nèi) 用夾層加熱至 7080℃ ，因噬菌體不耐熱，加熱可殺死發(fā)酵液內(nèi)的噬菌體，冷卻后，接入 2倍的原菌種， PH正常后再攪拌。 發(fā)酵初期發(fā)現(xiàn)感染噬菌體 ，可以利用噬菌體只能在生長階段的細(xì)胞中繁殖的特點(diǎn)，將發(fā)酵正常并已培養(yǎng)到對數(shù)期的發(fā)酵液加入感染噬菌體的發(fā)酵液中，以等體積混合后再發(fā)酵。 92 發(fā)酵培養(yǎng)方法 微生物發(fā)酵過程可分為 分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、混菌發(fā)酵、高密度發(fā)酵 及與產(chǎn)物回收結(jié)合的透析發(fā)酵、濾膜發(fā)酵等方法。 不同的發(fā)酵技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，了解生產(chǎn)菌在不同的發(fā)酵培養(yǎng)方法下細(xì)胞的生長、代謝和產(chǎn)物的變化規(guī)律，有助于發(fā)酵生產(chǎn)的有效控制。 93 分批發(fā)酵 ： 在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入 有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì) 后， 然后 接入少量的微生物菌種 進(jìn)行培養(yǎng)，在特定的條件下只完成一個(gè)生長周期的微生物培養(yǎng)方法。 ： （ 1）整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒有其它物質(zhì)交換； （ 2） 整個(gè)過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。 94 特點(diǎn) 分批發(fā)酵過程一般可分為四個(gè)時(shí)期，即延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期 ；也可以分為六期： 延遲期、加速期、對數(shù)期、減速期、靜止期和衰亡期 。 95 停滯期 ?A 現(xiàn)象： 剛接種后一段時(shí)間 ， 細(xì)胞數(shù)目和菌量不變 ，曲線平行于橫軸 。 ?。 ? ： 由于細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境 ,細(xì)胞數(shù)目無增長 ，甚至有所下降有一個(gè)適應(yīng)過程 ， 進(jìn)行大量的酶的生成 。 ? ? :細(xì)胞的新陳代謝非常旺盛 ， 個(gè)體體積顯著增大 ， 但不分裂繁殖 ， 為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備 。 96 ： 與菌種遺傳特性、菌齡、接種量、培養(yǎng)條件有關(guān)。 ： 在發(fā)酵工作中 ， 縮短遲緩期的措施： 1） 加大接種量 （ 群體優(yōu)勢 適應(yīng)性增強(qiáng) ） ； 2） 用對數(shù)期的種子 （ 此時(shí)細(xì)胞分裂旺盛 ） ； 3） 調(diào)整培養(yǎng)基的成分 ， 使種子基含有發(fā)酵培養(yǎng)基的成分； 4） 選用繁殖快的菌種 。 97 加速期 在延滯期后對數(shù)期前， 細(xì)胞生長速率逐漸加快 ，進(jìn)入短的加速期。此菌已完全適應(yīng)周圍的環(huán)境，由于有充足的營養(yǎng)，而且沒有抑制生長的有害物質(zhì)， 菌體開始大量繁殖，很快進(jìn)入對數(shù)期 。 98 對數(shù)期 1. 現(xiàn)象： 又稱指數(shù)期，生長迅速，細(xì)胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。 ： 此時(shí) 細(xì)胞的大小、形態(tài)、染色性、生理特征等均趨于一致 ，代謝活躍，對外界環(huán)境因素的作用敏感。生長速率高，代時(shí)穩(wěn)定。研究細(xì)菌的性狀時(shí)應(yīng)選用該期的細(xì)菌。 99 減速期 隨著 營養(yǎng)成分的減少、有害代謝產(chǎn)物的積累 ， 生長速度明顯放慢 。雖然細(xì)胞總數(shù)仍在增加，但是細(xì)胞的比生長速率開始下降，細(xì)胞在代謝與形態(tài)方面逐漸衰退，經(jīng)短時(shí)間的減速后進(jìn)入靜止期。 100 靜止期 ： 活菌數(shù)目不增不減，生長速率趨于 0,曲線有一下降的趨勢。 : 有害物增加 ， 死亡數(shù)增加 ， 細(xì)菌的芽胞 、 外毒素和抗生素等代謝產(chǎn)物在此期產(chǎn)生 ， 細(xì)胞內(nèi)開始貯藏物質(zhì) 。 穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高 。 101 衰退期 A 現(xiàn)象： 細(xì)胞死亡速率 生長速率 。 一般總菌數(shù)不變 ,活菌數(shù)曲線下降 。 B 特點(diǎn)： 死菌數(shù)多于活菌數(shù) ， 菌體變形 ， 大小不一 ， 細(xì)胞出現(xiàn)自溶 ,生理代謝活動(dòng)停滯 。 所有的發(fā)酵產(chǎn)品必須在進(jìn)入死亡期以前結(jié)束發(fā)酵 。 102 分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) : 操作簡單，周期短，染菌機(jī)會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。 缺點(diǎn) : 產(chǎn)率低。勞動(dòng)強(qiáng)度大，而且每批發(fā)酵的結(jié)果都不完全一樣，對分離提純造成了困難。 但由于操作相對較易，目前仍是發(fā)酵工業(yè)的主要方式。 103 1. 概念： 微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時(shí)，在發(fā)酵罐中不斷添加新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)不斷放出代謝物，使微生物細(xì)胞在近似恒定狀態(tài)下生長的發(fā)酵方式。 2. 特點(diǎn)： 連續(xù)發(fā)酵可使發(fā)酵罐內(nèi)的 液量維持恒定 ，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效的 延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)期 。在恒定的狀態(tài)下，微生物所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH、微生物細(xì)胞的濃度以及生長速率等可以始終維持不變 。 連續(xù)發(fā)酵 104 恒化連續(xù)發(fā)酵中 控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使?xì)胞消耗的營養(yǎng)及時(shí)得到補(bǔ)充 ，恒化器中的 營養(yǎng)組成基本恒定 ，從而保持細(xì)胞的恒定生長速率。 恒濁連續(xù)發(fā)酵中， 不斷調(diào)節(jié)流入和流出的速度， 保持培養(yǎng)液中的 濁度基本不變 。 連續(xù)發(fā)酵的類型 據(jù)控制方法 恒化連續(xù)發(fā)酵 恒濁連續(xù)發(fā)酵 105 多個(gè)發(fā)酵罐串聯(lián)起來，前一罐的出料作為下一罐的進(jìn)料；多級串聯(lián)可以提高生產(chǎn)能力。 多級連續(xù)培養(yǎng)特別適用于細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的最佳條件不同的情況。 例如用 葡萄糖 乳糖培養(yǎng)基 培養(yǎng)生產(chǎn) ?半乳糖苷酶 時(shí)，葡萄糖有利于菌體的生長，而酶的生產(chǎn)則受半乳糖的誘導(dǎo)，但葡萄糖又對半乳糖的利用產(chǎn)生阻遏作用。根據(jù)這一特點(diǎn)，靠采用二級連續(xù)培養(yǎng)。第一級用葡萄糖作為碳源，以獲得大量菌體，第二級加入半乳糖，促進(jìn)酶的生產(chǎn)。 據(jù)級數(shù) 單級連續(xù) 發(fā)酵 多級連續(xù) 發(fā)酵 106 連續(xù)培養(yǎng) 的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) : 1）可以保持恒定的操作條件，有利于微生物的生長代謝，從而使 產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量保持穩(wěn)定 ； 2）省去了反復(fù)放料、清洗、裝料、滅菌等步驟，避免了延遲期， 提高設(shè)備的利用率和單位時(shí)間產(chǎn)量 ； 3）發(fā)酵中各參數(shù)趨于恒值， 便于自動(dòng)控制 ； 4） 易于分期控制 ，可以在不同罐中控制不同的條件； 5）大規(guī)模的分批發(fā)酵，需要大型的后處理設(shè)備，而連續(xù)發(fā)酵中，一次收獲只獲得少量發(fā)酵液，下游所需的 設(shè)備規(guī)模也可相應(yīng)減少 。 107 缺點(diǎn) : a、長期連續(xù)培養(yǎng)會 引起菌種退化 ，降低產(chǎn)量，染菌機(jī)會增加。 b、 黏性絲狀菌 容易附著在器壁上生長和在發(fā)酵液內(nèi)結(jié)成團(tuán)，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來困難。 108 補(bǔ)料分批培養(yǎng) 介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的操作方法。 ： 根據(jù)菌體生長和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批培養(yǎng)的某些階段 適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基 ，使菌體或其代謝產(chǎn)物的 生產(chǎn)時(shí)間延長 。 優(yōu)點(diǎn)： (1)解除底物抑制和葡萄糖的分解阻遏效應(yīng)。 (2)延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間。 109 (3)可以達(dá)到高密度細(xì)胞培養(yǎng)； (4)稀釋有毒代謝產(chǎn)物、降低污染和避免遺傳不穩(wěn)定性。 缺點(diǎn)： (1)由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。 (2)由于物料的加入增加了染菌機(jī)會。 110 1）細(xì)胞的高密度培養(yǎng) ? 一般培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度有一定的限度，過高的底物濃度會抑制菌體的生長； ? 采用補(bǔ)料的方法將高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸加入反應(yīng)器，可使發(fā)酵液中的菌體濃度達(dá)到很高的程度，如 大腸桿菌濃度可達(dá) 145g/L。 2）發(fā)生底物抑制的過程 一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它們在較高濃度下會對菌體的生長產(chǎn)生抑制。 補(bǔ)料分批培養(yǎng)應(yīng)用 111 以某些很容易被微生物利用的物質(zhì)（如葡萄糖）作為碳源時(shí)，其某些分解代謝物會使細(xì)胞某些酶的合成受到阻遏； 采用補(bǔ)料的手段 將葡萄糖逐漸加入反應(yīng)器中，使發(fā)酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代謝物的積累，從而可以有效去阻遏。 3）分解代謝物阻遏 112 4）營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng) 一些營養(yǎng)缺陷型菌株可以積累某種有用產(chǎn)物，如氨基酸、核苷、核苷酸等，利用這些菌株進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)須補(bǔ)充其不能合成的物質(zhì)供生產(chǎn)所需； 但這些物質(zhì)過量存在時(shí)，可能產(chǎn)生反饋抑制或阻遏作用，影響產(chǎn)物的合成。 采用補(bǔ)料的方法可將這些物質(zhì)保持在低濃度水平，有助于提高產(chǎn)物的生產(chǎn)。 113 補(bǔ)料方式 間歇添加營養(yǎng)物質(zhì)后，其在發(fā)酵液中的濃度即會上升，然后隨著微生物的利用又下降；再次補(bǔ)入料液后，營養(yǎng)物質(zhì)濃度再次升高，然后再次下降，呈現(xiàn)較大的波動(dòng)。 間歇添加法 連續(xù)流加法 恒速流加 (constantflow rate) 指數(shù)流加 (exponentialflow rate) ◇ 恒速流加操作的 補(bǔ)料速度是定值 ，操作簡便，設(shè)備簡單； 最常用； ◇ 發(fā)酵液體積呈線性增長 ；由于在指數(shù)生長期，微生物的底物消耗也呈指數(shù)增加，恒速流加不能維持底物濃度不變，底物濃度會隨時(shí)間延長而逐漸降低。 114 混菌發(fā)酵 混菌發(fā)酵 也稱混菌培養(yǎng)，是指 多種微生物混合在一起共同利用一種培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵 。 混菌發(fā)酵的 菌種和數(shù)量大都是未知 的，必須通過培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件控制才能順利進(jìn)行。 混菌發(fā)酵可以利用 多個(gè)菌種的不同代謝能力的組合 ，完成單個(gè)菌難以完成的復(fù)雜代謝作用，可代替某些重組工程菌來進(jìn)行復(fù)雜的多種代謝反應(yīng)， 提高生產(chǎn)能力。 115 發(fā)酵設(shè)備 發(fā)酵設(shè)備是發(fā)酵工廠中主要的設(shè)備，它必需具備適應(yīng) 微生物生命活動(dòng)和形成產(chǎn)物的各種條件，促進(jìn)微生物新陳代謝，使之能在低消耗下獲得較高的產(chǎn)量 。 由于 微生物分厭氧和通風(fēng)兩大類 ，故供微生物生存和代謝的生產(chǎn)設(shè)備也就各不相同。 不論厭氧或通風(fēng)發(fā)酵設(shè)備， 除了滿足微生物培養(yǎng)所必要的工藝要求外，還得考慮材質(zhì)的要求以及加工制造難易程度等因素。