【正文】 烷溶液中 , 硅烷與二氧化硅共價結合 , 異雙官能交聯(lián)劑 N琥珀酰亞胺 3馬來酰亞胺丙酸 (SMP) 的一端與硅烷結合 , 另一端的馬來酰亞胺基團與半胱胺酸殘基的硫氫基共價結合 , 這樣含 RGD 序列和半胱胺酸殘基的細胞粘附肽就共價固定在二氧化硅底物表面 【 76】 。 研究發(fā)現(xiàn)， RGD組裝成的納米尺度的團簇結構比無 規(guī)肽結構更能有效地誘導細胞的黏附和移動 ,所以修飾材料表面的 RGD 密度也要適宜。 Maheshwari等 【 77】將 YGRGD 肽固定在無粘附活性的材料上 , 制成具有不同的表面配體濃度及不同的 23 簇狀空間分布特征 , 觀察 NR6 成纖維細胞的粘附、移動情況 , 結果發(fā)現(xiàn) NR6 成纖維細胞的移動速率依賴于配體空間分布。在相同的表面配體濃度時 , 簇狀固定的YGRGD肽更能提高 NR6成纖維細胞的移動速率 。而非簇狀固定的 YGRGD肽即使在最高的表面配體濃度時 , 也幾乎不支持 NR6成纖維細胞的移動。 將肽固定在材料表面可由于空間 阻礙而降低肽的活性。添加氨基酸殘基或其他基團 , 或將多肽固定材料上也會改變肽原來的功能 , 表現(xiàn)為肽活性的降低 , 所以在固定多肽時應注意添加基團的溶解度、復合物的二維結構、三維結構改變以及空間阻礙效應 【 78】 。 研究表明 ,含肝素結合域的 ECM蛋白質 ,如成纖蛋白 ,作為輔助因子與 RGD序列共同促進細胞的粘連和擴展。 Rezania等 【 79－ 80】 發(fā)現(xiàn) ,通過引入合適比例的細胞結合域與肝素結合域肽鏈來修飾材料表面 ,以模仿骨的非膠原 ECM,可以大大促進細胞的擴展和 ECM的鈣化 ,最終調控成骨細胞表型的表達。 在硬組織工程 研究中 ,磷酸鈣表面修飾的生物陶瓷和可植入金屬以其良好的生物相容性和骨整合性能 ,越來越多地應用于牙和骨修復。在 Varma等及 Barrere 等的研究中 ,應用仿生的方法 ,可分別在磷酸化的殼聚糖膜和鈦合金 Ti－ 6AL－ 4V 表面以磷酸鈣涂層修飾。更令人關注的是 ,通過模擬體液環(huán)境 , 實現(xiàn)了 Ca/P比例的調節(jié)。姚康德等以糖胺聚糖 (GAGs)結構類似物殼聚糖及其衍生物修飾聚乳酸膜 ,并以鼠顱骨成骨細胞體外培養(yǎng)進行評價。結果表明 ,修飾膜明顯改進了聚乳酸的細胞親和性 ,促進了成骨細胞的黏附、增殖及堿性磷酸酶活性的表達。 通過本 體聚合在聚合物主鏈引入功能基團 ,可 形成含 RGD肽鏈的雜化聚合物。中山大學高分子研究所全大萍教授及華中科技大學鄭啟新教授等 【 81－ 83】 通過 Asp與聚乙二醇 ( PEG) 的聚合物大分子引發(fā)乙丙交酯共聚 ,設計合成了側鏈含氨基的聚 [乙 /酸酯 (天冬氨酸 alt聚乙二醇 )x乙 /酸酯 ]嵌段共聚物。具體方法是在對甲苯磺酸催化下將不同分子量的多縮或聚乙二醇 (EG或 PEG)分別與 N芐氧基天冬氨酸酐縮聚 ,合成系列側鏈含氨基的 AspaltEG(PEG)交替共聚物 , 再以其為大分子引發(fā)劑 ,引發(fā) LA和 GA開環(huán)共聚 ,合成出 含側氨基的[PLGA(AspaltPEG)xPLGA] 聚 [乙 /酸酯 (天冬氨酸 alt聚乙二醇 )x乙 /酸酯 ]嵌段多元共聚物。結果顯示 , 通過調整 PEG鏈段的長度 ,可以控制調整聚合物中氨基密度和分布 ,為調整多肽的密度和分布創(chuàng)造了條件。 鄭啟新教授等研究發(fā)現(xiàn)，和單純 PLGA 材料相比，三嵌段改性材料對骨髓基質干細胞的黏附性明顯提高 【 84】 。鄭啟新教授等進一步設計了系列含 RGD 多肽，均成功地固定在此三嵌段材料表面；同時通過篩選發(fā)現(xiàn)， GRGDSPC 多肽對骨髓基質干細胞的黏附能力最強，具有相對特異性。郭曉 東等設計了一種含 RGD 多肽，可以作為非病毒基因轉染載體，將其固定在此三嵌段材料表面，可以成功地將對骨組織工程至關重要的轉化生長因子 β 1基因轉染于骨髓基質干細胞，體現(xiàn)了“基因活化基質材料”的理念 【 85－ 87】 。 24 采用蘋果酸和乙醇酸制成的交酯 BMD均聚或共聚，可以在聚合物側鏈引入功能基團，形成含 RGD肽鏈的雜化聚合物。 BMD 的合成一般是從蘋果酸出發(fā) ,在一個羧基被保護的情況下制備六元環(huán)單體。 BMD的反應活性與 LA、 GA 比較接近 ,由于自身均聚分子量不高 ,一般是將 BMD 與 LA 或 GA 共聚 ,合成主鏈含乙醇酸－蘋 果酸兩元或乙醇酸－蘋果酸－乳酸三元共聚物 ,這種共聚物結構和性能可以很方便地通過調節(jié)各組成的比例進行控制 ,在藥物緩釋和組織工程中更有應用價值。Kimura 等以天冬氨酸為原料合成了 BMD ,該交酯與 LA 共聚合 ,合成主鏈含 LA、 GA 和 MA 的共聚物。共聚物在 Pd/C 作用下脫去保護 ,溶液澆鑄成膜 ,或先成膜 ,在堿性條件下水解脫去保護基團 ,使其表面為羧基 ,可以通過偶聯(lián)劑二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC) 將小肽序列精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 絲氨酸 (RGDS) 接枝到 COOH 上。結果顯示 ,固定 RGD 后的膜比未固定的 膜顯示出更好的細胞黏附性 ,而且共聚物中蘋果酸單元的成分越高 ,固定 RGD的數量越多 ,細胞黏附性越好。 在聚合物主鏈末端引入功能基團固定 RGD 也是制備聚合物 含 RGD 肽鏈的雜化分子的一條途徑。為克服蛋白在生物材料表面的非選擇性吸附 ,促進細胞的特異性黏附 ,J 等采用一端為氨基的聚乙二醇 (H2NPEGOH) 引發(fā) LA 開環(huán)共聚得到 H2NPEGPLA二嵌段共聚物 ,利用聚合物末端氨基分別鍵合琥珀酰亞胺酒石酰胺、琥珀酰亞胺琥珀酰胺、馬來酰亞胺丙酰胺 ,合成出三種端基含活性基團的聚合物?？梢岳镁酆衔镏邪被?、雙羥基鍵合蛋白和多肽 (RGD , 生長因子 ) ,這種具有反應活性的聚合物既可用作多孔的組織工程支架 ,也可用作藥物緩釋材料。在琥珀酰亞胺酒石酰胺末端固定胰島素和生長激素抑制素后的結果表明 ,修飾過的聚合物對于蛋白的黏附具有更好的選擇性 ,對于調節(jié)細胞的功能促進組織的再生有重要的價值。鄧先模等使用末端為氨基的聚乙二醇單甲醚 己內酯(MPEGPCL)為大分子引發(fā)劑引發(fā)帶有芐氧基保護基團的天冬氨酸酐 ,最終合成端基為氨基和甲氧基的聚乙二醇 聚己內酯 天冬氨酸共聚物 (MPEGPCLPBLA) 。他們還采用乳酸的亞 硫酸酯酐 (LAAS) ,帶有保護基團的絲氨酸酐和甲氧基聚乙二醇胺 (MPEGNH2 ) 共聚 ,得到含有 PLA、 PEG和聚氨基酸的三嵌段共聚物 ,在高聚物鏈末端引入了氨基 ,為進一步固定 RGD 等生物因子創(chuàng)造了條件。 水凝膠體系由于具有高親水性 ,與軟組織的類似性 ,能為細胞和生物活性因子提供溫和的生存環(huán)境 ,在負載 RGD等生物因子方面具有更潛在的應用價值。蛋白和多肽可以被水凝膠物理包覆 ,也可以與形成水凝膠的聚合物鍵合。組織工程研究中常采用的是由聚乙烯醇 (PVA) 和 PEG制備的水凝膠 ,如 Burdick 等將 PEG4600一端丙烯?；?, 一端由 N羥基琥珀酰亞胺活化后鍵合 RGD肽 ,光引發(fā)聚合形成水凝膠 ,發(fā)現(xiàn)可以提高小鼠成骨細胞在聚合物表面的黏附 ,擴散 ,而且 RGD密度越大 ,細胞擴散程度越大 ,顯示了這種材料在體內注射成型方面有巨大潛力。聚反丁烯二酸丙二醇酯 (PPF) 是一種含有很多不飽和雙鍵的鏈狀聚酯 ,由于其交聯(lián)聚合物的水解產物是人體自然存在的物質 ,成為目前水凝膠研究的一個熱點。 Mikos等采用聚 (反丁烯二酸丙二醇 co乙二醇 ) 共聚合 ,丙烯?；垡叶己捅；?25 乙二醇 生物素 (或多肽 ) 在過硫酸銨存在下交聯(lián)制得了偶聯(lián)有 生物素 (或多肽 ) 的水凝膠 ,并證實可通過控制 PEG鏈段的長度、 PEG在聚合物中的比例和 PPFPEG的分子量 ,控制生物素 (或多肽 ) 在凝膠表面的含量。 2 生物材料表面的拓撲結構修飾 基底膜作為細胞的底物廣泛存在于脊椎動物的體內 , 主要由細胞外基質蛋白組成 , 包括透明質酸、蛋白多糖、層粘連蛋白 (laminin) 和纖維連接素(fibronectin)?；啄さ谋砻婊瘜W特征、機械伸展性對細胞和組織的行為、功能有很大影響。除此之外 , 基底膜表面具有復雜的三維納米結構特征，如納米級的孔、嶺 (ridge) 和纖維細 絲等。早在 20世紀 40年代 , 就有學者提出“接觸引導”(contact guidance) 的概念 , 70 年代開始研究納米結構特征對細胞行為的影響。 利用電子顯微鏡測量猴角膜上皮細胞基底膜表面的特征結構時發(fā)現(xiàn) , 特征結構的平均高度在 147～ 191nm 之間 , 平均纖維細絲的寬度約為 77nm。 孔的平均直徑為 72nm , 約占基底膜總面積的 15%。在人角膜上皮細胞基底膜表面也觀察到類似的特征結構。 Shirato等 【 88】 在鼠腎小球基底膜上觀察到網篩 (meshwork) 結構 , 內層由 5～ 9nm 厚的原纖維和 11～ 30nm寬的孔組成。外層由 6～ 11nm厚的原纖維 和 10～ 24nm寬的孔組成。 從材料學的角度講 ,材料結構決定材料性能 ,所以表面微觀結構對表面性能有重大影響。 組織工程用基質材料 表面的拓撲結構 (表面的粗糙度、孔洞的大小及分布、溝槽的尺寸和取向等 ) 對種子細胞的黏附、鋪展、增殖、分化、功能表達有很大影響 ，即可 產生“材料的誘導性生物效應” 。 不同的粗糙程度及不同的表層微觀形貌結構如凹槽型 、 山脊型 、 孔洞型等對細胞的粘附 、 定向生長 、 遷移都有直接不同的影響 。 利用血細胞形態(tài)和生長模式的超微評估方法 ， 發(fā)現(xiàn)與光滑表面相比 ， 上皮細胞和成纖細胞更易附著于微粗糙表面 (即表面的起伏在 10nm50181。m范圍以內 )， 而且在該表面生長更快 ， 表現(xiàn)出更密集的細胞生長現(xiàn)象 ， 說明微粗糙表面能增強細胞的粘附 。 同時對表層微觀形貌結構對細胞的極化和定向生長的影響研究發(fā)現(xiàn) ， 表面規(guī)則凹槽形的深度和寬度都對細胞生長有影響 。 但相對而言 ， 凹槽深度對細胞的定向生長的影響要大于凹槽寬度的影響 ； 通常隨著凹槽深度加深 ， 它對細胞的定向生長的影響也變大 ， 但隨著凹槽寬度加寬 ， 其對細胞的定向生長的影響卻變小 。 同時凹槽間的間隔對細胞的定向生長也有影響 ， 隨著凹槽間隔的變大 ， 其對細 胞的定向生長的作用逐漸消失 ， 當表面同時存在大小不同的凹槽時 ， 細胞更傾向于在較大凹槽內生長 ， 同時研究還發(fā)現(xiàn) ， 不同的細胞類型對凹槽深度的響應是不同的 ， 如 P388D1巨噬細胞的響應尺度至少不大于 44nm,上皮細胞 、 內皮細胞 、 成纖細胞等的響應尺度至少不大于 70nm。 例如 , 在覆鈦植入物上 , 上皮細胞會明顯地沿著 10181。m 深的溝槽定向排列 ,而骨細胞則“忽略”深度為 5181。m 的溝槽。 當凹槽的寬度明顯大于細胞尺寸時 ， 細胞的定向響應不明顯 ； 而當凹槽的寬度比細胞尺寸小或相當時 ， 細胞的定 26 向響應就很明顯了 。 Chung 等先將聚乙 二醇 (PEG) 接枝到聚氨酯 (PU) 表面 ,生成接枝產物 PU－PEG,再將 N－ 琥珀酰亞胺 / 6－ (4－ 疊氮 － 2－ 硝基苯胺 ) / 己酸酯 (SANPAH) 和多肽 Gly－ Arg－ Gly－ Asp (GRGD) 分別溶于乙醇和蒸餾水中 ,室溫暗室共混反應 2h ,生成苯基疊氮衍生多肽 ,最后通過紫外光照射將其固定在 PU－ PEG表面 ,在納米尺度上提高了表面粗糙度 ,MTT 檢測表明體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞生長速率有所提高。 細胞在識別材料表面特征時 ,可響應微米和納米尺度的表面拓撲結構 ,產生接觸引導 ,所以人們可利用材料表面拓 撲結構來調控細胞行為。很多文獻報道了材料表面的拓撲結構對細胞的鋪展、取向及遷移的影響。 Dalby 等利用聚苯乙烯(PS) 和聚 (4－ 溴代苯乙烯 ) (PBrS) 共混澆鑄成膜 ,表面形成島狀拓撲結構 ,種植入成纖維細胞后發(fā)現(xiàn) ,細胞對島狀結構非常敏感 ,黏附后迅速產生絲狀偽足 ,細胞骨架迅速形成。為了研究大量存在的單個細胞的個體行為 , Singhvi 等設計了在金表面構建由十六烷基硫醇自組裝而成的具有蛋白吸附能力的微米級“小島”的方便的柔性方法。這些小島的尺度、形態(tài)都是可以控制的。鼠肝細胞培養(yǎng)結果表明 , 在面積為 10000181。m2 的“小島”上肝細胞的白蛋白分泌速率最大 。 而在面積為 1600181。m2的“小島”上白蛋白分泌速率最為穩(wěn)定。 生物材料表面的微結構域可以調控細胞與基質的信號傳導 ,從而影響細胞黏附結構域的形成和細胞骨架的發(fā)育 ,最終形成具有高度取向的細胞圖案。研究發(fā)現(xiàn) ,條紋幾何形狀的表面有利于細胞的取向和運動。 Matsuzaka 等將鼠骨髓細胞種植在具有細微紋溝的聚乳酸表面 ,培養(yǎng) 8d 后 ,發(fā)現(xiàn)細胞呈扁平狀 ,與表面紋溝平行排列分布 。培養(yǎng) 16d 后 ,發(fā)現(xiàn)礦化基質沉積在表面 ,且與表面紋溝平行排列分布。表面微紋結構基體上的細胞堿 性磷酸酶 (ALP) 活性明顯高于表面光滑基體上的細胞 ,這表明表面微紋拓撲結構對細胞生長有一定促進作用 [7 ] 。生物材料表面的微圖案化 ,有望促進且調控特異細胞的生長和空間分布。 與光滑表面相比 ， 多孔結構能顯著增加成纖細胞 、 軟骨細胞的生長速率 。 對于表面具有孔洞型結構的支架研究發(fā)現(xiàn) ， 當孔徑較小時 （ 如 2－ 5181。m）細胞在其表面的生長速率要比孔徑大時 （ 如 10181。m）大得多 ， 且孔洞尺寸與材料憎水性與組織反應影響程度相比