生化分離工程2萃取分離(1)-資料下載頁(yè)
2024-10-16 15:01本頁(yè)面
【正文】 鹽系統(tǒng)中， pH和其分配系數(shù)之間的關(guān)系應(yīng)不同，而在等電點(diǎn)時(shí)，得到的均為不帶電時(shí)分子的分配系數(shù)。對(duì)不同的鹽系統(tǒng)，其等電點(diǎn)時(shí)的分配系數(shù)應(yīng)相等，兩條 pH和分配系數(shù)關(guān)系的曲線必交于一點(diǎn)，該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的 pH值即為該特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。根據(jù)這一原則測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法，稱為交錯(cuò)分配法 (Cross partitioning)， 如圖 211所示。 2021321 36 圖 211 血清蛋白在兩種鹽系統(tǒng)中 分配系數(shù) K 與 pH 的關(guān)系 (交錯(cuò)分配 ) 2021321 37 ? 體系溫度的影響 ? 溫度影響相圖，同時(shí)影響分配率和蛋白質(zhì)的生物活性。一般地，臨界點(diǎn)附近，溫度對(duì)分配率的影響較大，遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)，影響較小。 ? 在考慮溫度對(duì)分配率的影響時(shí)，必須考慮到過程的冷量消耗和分離過程中蛋白質(zhì)的停留時(shí)間。由于親水聚合物的多元醇或多糖結(jié)構(gòu)保護(hù)了蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在雙水相中的穩(wěn)定性增加，所以一般都可在室溫下操作。從省掉冷卻系統(tǒng)的室溫操作過程中各相前后溫度的變化可知，分離后上、下相的溫度上升不多，說(shuō)明無(wú)冷卻系統(tǒng)的室溫操作是可行的。 2021321 38 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用 ? 雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。 ? 用雙水相萃取技術(shù)處理細(xì)胞勻漿液，既可方便地除去細(xì)胞碎片，還可使酶得到精制。 ? 要成功地運(yùn)用雙水相萃取方法，應(yīng)滿足下列條件 ① 欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中； ② 酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時(shí)一次萃取，就能得到較高的收率； ③ 兩相用離心機(jī)很容易分離。 2021321 39 ? 在雙水相體系中，通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相(PEG)， 而細(xì)胞碎片分配在下相 (鹽 )。 ? 表 56中蛋白質(zhì)在多數(shù)情況下收率能達(dá)到 90％；分配系數(shù) K在 2～ 20之間，一般能大于 3；很多雜蛋白也能同時(shí)除去。 PEG／ 鹽系統(tǒng)應(yīng)用得很廣泛，主要由于PEG價(jià)格低廉以及該系統(tǒng)選擇性。 ? 萃取操作時(shí)單位重量相系統(tǒng)中勻漿液的加入量一般每 1 kg萃取相系統(tǒng)以處理 200～ 400 g濕菌體為宜。 ? 使用 PEG／ 鹽系統(tǒng)提取胞內(nèi)酶時(shí)，使細(xì)胞碎片分配到下相中是比較容易的，如用 18%的 PEG 1550、 7％ 磷酸鉀系統(tǒng)處理 20％濕細(xì)胞碎片時(shí)，細(xì)胞碎片能全部轉(zhuǎn)入下相 (鹽相 )。 2021321 40 圖 212 三步萃取流程示意圖 2021321 41 ? 分配在上相中的蛋白質(zhì)可通過加入適量的鹽 (有時(shí)也補(bǔ)充適量的 PEG)， 進(jìn)行第二次雙水相萃取，目的是除去核酸和多糖，它們的親水性較強(qiáng)，因而易分配在鹽相中，蛋白質(zhì)就停留在上相 PEG中 ? 在第三次萃取中，應(yīng)使蛋白質(zhì)分配在鹽相 (如調(diào)節(jié) pH)，以便和主體 PEG分離，色素因其憎水性而通常分配在上相；鹽相中的蛋白質(zhì)可用超濾法棄除殘余的 PEG，主體 PEG可循環(huán)使用。 ? 雙水相萃取法另一優(yōu)點(diǎn)為易于放大，分配系數(shù) K值重復(fù)性好，故可直接放大。下面以甲酸脫氫酶 (FDH)的分步提取和純化來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明雙水相在胞內(nèi)酶提取中的應(yīng)用。 2021321 42 圖 213 連續(xù)萃取流程示意圖 2021321 43 雙水相萃取技術(shù)的進(jìn)展 ?進(jìn)一步提高目的蛋白的純度 ? 目的物還含有少量的核酸和多糖，進(jìn)一步提高目的蛋白的純度，可從雙水相體系和萃取操作方式兩方面進(jìn)行改進(jìn)。 ? 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的 PEG衍生物。如在 PEG上引入親和基團(tuán)或離子基團(tuán)： (CH3)3N＋ PEGN＋ (CH3)3， ConAPEGConA等。目的蛋白的得率和純度都有很大的提高。 ? 可采用多級(jí)萃取。 2021321 44 ? 廉價(jià)雙水相體系的開發(fā) ? 生物工程中得到應(yīng)用的兩種雙水相體系，即高聚物／高聚物和高聚物 /鹽體系。兩種體系比較見表 23。 表 23 兩種雙水相體系的比較 體系 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) PEG/dextran 鹽濃度低 ， 活性損失小 價(jià)格貴 ， 粘度大 ， 分相困難 PEG/鹽 成本低、粘度小 鹽濃度高，活性損失大，界面吸附多 ? 從表可見，高聚物 /高聚物體系對(duì)活性物質(zhì)變性作用小，界面吸附少，但價(jià)格高。因而尋找廉價(jià)的高聚物 /高聚物雙水相體系是雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)重要發(fā)展方向。 2021321 45 ? 目前比較成功的是用變性淀粉 PPT（ hydroxypropyl derivative of starch）代替昂貴的 Dextran。 ? PPT/PEG體系比 PEG/鹽體系穩(wěn)定。和PEG/dextran體系相圖非常相似： ①蛋白質(zhì)溶解度大。蛋白質(zhì)在 PPT濃度到 15％以前沒有沉淀，而在 PEG濃度大于 5％時(shí)，溶解度顯著地減小。 ②粘度小。 PPT的動(dòng)力粘度只是粗 Dextran的 1/2，因而可以大大改善傳質(zhì)效果。 ③價(jià)格便宜。 2021321 46 ?雙水相萃取技術(shù)同其他分離技術(shù)結(jié)合 ① 雙水相體系同生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合 ? 將雙水相萃取同生物轉(zhuǎn)化結(jié)合在一起，可解決在許多生物轉(zhuǎn)化中存在的兩個(gè)問題：一是由于雙水相體系對(duì)菌體及酶沒有毒性，同時(shí)又可將產(chǎn)物萃入上相，所以可消除產(chǎn)物抑制效應(yīng)；二是使分布在下相的細(xì)胞 (酶 )循環(huán)使用，從而為固定化細(xì)胞及酶的應(yīng)用開辟了新路。 ② 雙水相萃取同膜分離技術(shù)結(jié)合 ? 可解決雙水相體系容易乳化和生物大分子在兩相界面的吸附等問題并能加快萃取速率。
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