【正文】 。 人紅細胞采用 EDTA抗凝血 ． 綿羊紅細胞予先用成人血清在21℃ 作用 60分鐘 。 所有細胞均用改良 Hanks液洗三遍配成所需濃度 。 試驗時在試管中加入 2％ 的人紅細胞 ， 2％ 的抗體予處理過的綿羊紅細胞 ，再加 — 1： 5稀釋的人臍血清作補體來源 。 ? 混合后即取一滴臵載玻片上 ， 上加蓋片 ，室溫 （ 20— 23℃ ） 作用 20分鐘 ， 相差顯微鏡下隨機計數(shù) 100個人紅細胞 ， 以粘附至少一個羊紅細胞為陽性 ， 算出百分率 。由于人紅細胞平均直徑 7－ 8181。m， 而羊紅細胞只有 4－ 5181。m， 兩者相差近一半 ， 故鏡下不難區(qū)別 。 ? （ 2 ） 免疫粘 附血凝試 驗 （ immune adherence haemagglutination IAHA） ：用人混合血清經(jīng)鹽析和二乙胺乙基纖維素層析得到人 IgG。 70℃ 保存 。 用時溶于磷酸緩沖液 ， 65℃ 加熱 30分鐘 ， 冰水冷卻 ， 15000g離心 15分鐘 。 取上清為人聚合丙種球蛋白 （ AHG） 。 在 U型微滴定板上將 AHG系列倍比稀釋 （ 原始濃度100181。g／ ml） 每孔 25181。l， 再加等量補體 ，37℃ 作用 45分鐘 ， 加入二硫基蘇糖醇溶液固定 。 ? 然后將待測紅細胞用 EDTAGVB 配成 2 108／ ml， 取 25181。l加入各孔 ， 臵 24℃下 60分鐘后觀察結(jié)果 。 IgG聚合后暴露出 C3b結(jié)合點與補體 C3b結(jié)合 ， 加入蘇糖醇固定使 C3b不被降解 ， 可與紅細胞表面 C3b受體結(jié)合而致紅細胞凝集 。 以發(fā)生血凝的 AHG的最高稀釋度的倒數(shù)為 IAHA的效價 ， 表示 C3b受體的活性 ， 此法敏感性與特異性均高 。 ? （ 3 ） 血吸附法 （ Haemadorption technique， HA） ：待測紅細胞用 PBS洗三遍 ， 3000xg離心作成集塊 ， 液氮速凍 ，切成 68181。m厚的切片 ， 臵蓋玻片上 。 用兔抗羊紅 IgM抗體致敏羊紅細胞 、 加血清 37℃ 作用 10分種 ， 形成抗原抗體補體復合物 ， 洗過二遍用 GVB配成 1％ 的懸液作指示細胞 。 ? 在微培養(yǎng)載片的凹孔中加滿指示細胞 ，蓋上覆有紅細胞切片的蓋片 ， 使切片正好位凹孔中央 ， 顛倒載片使指示細胞下沉到紅細胞切片上 ， 室溫臵 30分鐘再倒回來 ， 使未結(jié)合的指示細胞離開玻片 。結(jié)果判定以待測紅細胞緊密結(jié)合一層指示細胞為 3+， 部分覆蓋指示細胞為 2+，散在結(jié)合為 +， 沒有血吸附現(xiàn)象 ， 該法比血凝法更敏感 。 ? （ 4） 放射免疫測定法 （ Radiohomunoassay，RIA：根據(jù)放射性同位素標記部位不同有幾種方法 。 ? 放射碘標記抗人 IgG抗體法：將一定濃度的待測紅細胞 、 AHG和人補體臵 37℃ 共同作用 30分鐘 ， 使 AHG通過補體 C3b結(jié)合到紅細胞膜 C3b受體上 ， 洗滌過后再加入碘標記的兔抗人 IgG，4℃ 作用 30分鐘 ， 使碘標抗體結(jié)合到 AHG上 ，然后將紅細胞洗過 ， 測其放射性 ， 結(jié)果用待測紅細胞吸收的放射碘標記抗人 IgG量與正常人紅細胞吸收量之比的平均值表示 。 ? 放射碘標記 F（ ab`） 2法：靜脈抗凝血紅細胞 0℃ 下洗過配成一定濃度 ， 加人 125碘標記的非免疫 F（ ab`） 2或 125碘標記的抗 C3b受體 F（ ab`） 2， 20℃ 作用 60分鐘 ，各取 丁酯的微量離心管中 ， 8000g離心 30秒 ，切斷離心管 ， 管中沉淀和上清液分別含結(jié)合與未結(jié)合的抗體 。 抗 C3b受體的 F（ ab`） 2結(jié)合量減去非免疫 F（ ab`） 2結(jié)合量 ， 得出特異結(jié)合量 ， 按 Scatchard法算出每個紅細胞抗原飽和量 。 ? 放射碘標記二聚體 C3b法：將一定濃度的紅細胞與 125碘標記的二聚體 C3b單獨或加 C3b受體 F（ ab`） 2，0℃ 共育 20分鐘 ， 再用上述微量沉淀法分離開結(jié)合與未結(jié)合的配體 ， 未加抗體管的結(jié)合量減去加人抗 C3b受體 F（ ab`） 2管的結(jié)合量 ， 則為特異結(jié)合量 ， 再按scatchard法計算出紅細胞結(jié)合 C3b的量 。 ? 放射碘標記抗人 C3b受體單抗法：用純化人紅細胞 CR1免疫小鼠取鼠脾細胞與漿細胞瘤細胞融合 ， 生產(chǎn)抗 CR1的單克隆抗體 。 用 125碘標記單抗加待測紅細胞 37℃ 作用 30分鐘 ， 取 50181。l加入微量離心管 ， 8000g離心 30秒 ， 切去頂部 ，于 r計數(shù)器內(nèi)測定放射量 ， 算出紅細胞表面受體數(shù) 。 或?qū)⒓t細胞溶解后取二個稀釋度的提取物加入包被 C3b的塑料板孔內(nèi) 。 37℃ 作用 2小時 ，洗過后加 125碘標記的抗 CR1單抗 ， 臵室溫 1小時 ， 洗過后切開 ， γ 計數(shù)儀測放射量 ， 再由純化 CR1所作的標準曲線中 ， 求得紅細胞提取物的受體量 。 該法特異性強 。 ? （ 5 ） 間 接 血 凝 法 （ indirect heamagglutination techwue， IHA） ：用 PBS將鼠抗 CR1單克隆抗體對倍稀釋加入等量 5％ 待測紅細胞懸液 ， 4℃ 作用 1小時 ， 然后將微滴定板傾斜使其近乎垂直約 10分鐘 。 未凝集的紅細胞則象淚滴一樣地流出來 ， 而凝集的紅細胞則粘附在孔底 ， 結(jié)果以能引起凝集的抗 CR1抗體的最高稀釋度表示 。 該法避免了一般單抗法放射標記的過程 。 ? （ 6） 酶聯(lián)免疫吸附試驗 （ Empme－Linked Immunosorbent Assay， ELISA） ：取 100181。lPLL(聚 L溶素 )加入平底聚苯乙烯96孔微滴定板的各孔中 ， 20℃ 下孵育 30分鐘 ， 翻過板來倒空 ， 用吸水紙反復吸凈 。 待測紅細胞用 PBS洗過三遍配成懸液 ，取 100181。l同時加人四孔中 （ 每孔約 5 106個細胞 ） ， 室溫臵 30分鐘 。 再加 ％ 的戊二醛 PBS溶液 100181。l ， 22℃ 放臵 30分鐘 。 棄去戊二醛 ， 加 200181。l PBS， 3分鐘后倒空 ， 吸水紙吸 ， 重復洗三遍 。 ? 再加 1％ 小牛血清 250181。l 22℃ 作用 60分鐘 ，洗三遍將未結(jié)合血清沖掉 。 然后取 100181。l PBSl:100稀釋的鼠抗人 C3b受體單克隆抗體加人各孔 ， 22℃ 孵育 60分鐘 ， 洗三次 ，堿性磷酸酶結(jié)合的兔抗鼠 IgG ， 用PBSl:100稀釋 ， 取 100181。l加入各孔 ， 22℃孵育 60分鐘 ， 再洗三次 ． 最后將 200181。l新配制的底物溶液加人各孔反應 60分鐘 ，每孔取 150181。l反應產(chǎn)物臵另一板的相應孔中 ， 在 405um測吸光度 。 該法不需要同位素標記 ， 也避免了大試管 ELISA法底物使紅細胞溶解的缺點 。 ? （ 7 ） 流 式 細 胞 儀 測 定 法（ Folwcytometric assay， FCA） ：待測紅細胞用 1%小牛血清磷酸鹽緩沖液（ PBC ． FCS ） 洗三遍 ， 然后再配成． 108／ ml的懸液 。 取 10181。l加鼠抗人單克隆抗體 50181。l（ ／ ml） 冰育 40分鐘 。 再用 2ml的 ， 加熒光素異硫氰酸鹽 （ FITC） 標記的兔抗鼠免疫球蛋白 （ F234） 30181。l（ l／ 20稀釋 ） ， 或者加 1／ 50稀釋的 （ FITC） 標記的兔抗大鼠免疫球蛋白 （ F234） 30181。l冰浴30分種 ， 洗二遍 。 ? 用 ％ 的多聚甲醛鹽水溶液 800181。l將紅細胞重新混懸及固定 。 鼠抗人 CD 鼠抗人生長激素 、 正常鼠血清或二級抗體可單獨用作對照 ． 用流式細胞儀檢測 24小時內(nèi)標記的紅細胞 2021個 。 紅細胞 CR1水平用中位熒光頻道 （ MFCN） 表示 。該法結(jié)果精確 。 ? （ 8） 除上述方法外 ， 還可根據(jù)紅細胞膜上 C3b受體在血清 I因子滅活 C3b時起輔因子的作用采用酶活性測定法 （ Enzymic assay， EA） ：將人 C3b分離出來用 125碘標記 ， 加入固定濃度的 I因子 ， 再加人待測紅細胞或紅細胞膜的提取物 ，37℃ 下共同作用一段時間 ， 中止反應后 ， 用SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳 ， 用放射照相術(shù)觀察凝膠上碘標蛋白的裂解圖像 ， 然后將凝膠切成小條測其放射性 。 通過測量 C3b的 α 鏈位臵上放射性與凝膠總放射活性之比 ， 可得出 C3b降解的程度 ， 從而推斷紅細胞膜上 C3b受體的活性 。 紅細胞免疫在臨床應用的研究 ? 紅細胞免疫發(fā)展的顯著特點 ， 就是人們在重視紅細胞免疫基礎理論和實驗方法研究的同時 ， 也重視了臨床應用的研究 ，將紅細胞免疫與臨床各科疾病緊密地結(jié)合起來 。 從目前已報導的資料來看 ， 臨床上大部分和紅細胞免疫功能有關(guān) 。 如自身免疫性疾病 、 腫瘤 、 傳染病 、 變態(tài)反應病 、 老年病 、 內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等 ，以及外傷 、 創(chuàng)傷 、 感染 、 溫度 、 血液庫存時間等因素均可導致紅細胞免疫功能的變化 。 郭峰將臨床疾病紅細胞免疫功能的變化分為三個類型： ? （ 1） 代償性紅細胞免疫功能缺陷或繼發(fā)性紅細胞免疫功能缺陷： ? 其表現(xiàn)為紅細胞 C3b受體花環(huán)率下降 ， 紅細胞免疫復合物花環(huán)率升高 ， 血清中紅細胞免疫促進因子 （ RFER） 含量下降（ 或變化不顯著 ） ， 紅細胞免疫抑制因子 （ RFIR） 含量升高 ， 腫瘤紅細胞花環(huán)率 （ NTER、 DTER、 ETER、 ATER） 一般都有下降 ， 如腫瘤 、 傳染病等患者的紅細胞免疫功能表現(xiàn) 。 ? （ 2） 失代償紅細胞免疫功能缺陷或原發(fā)性紅細胞免疫功能缺陷： ? 其表現(xiàn)為紅細胞 C3b受體花環(huán)率和紅細胞免疫復合物花環(huán)率均下降 ， 如少數(shù) SLE、PNH、 慢性化膿性骨髓炎等患者的紅細胞免疫功能表現(xiàn) 。 ? （ 3） 紅細胞免疫功能紊亂與亢進： ? 其表現(xiàn)為紅細胞 C3b受體花環(huán)率升高 ，紅細胞免疫復合物花環(huán)率亦升高或變化不顯著 。 如硬皮病 、 原發(fā)性癲癇 、 銀屑病等患者的紅細胞免疫功能表現(xiàn) 。 ? 臨床疾病紅細胞免疫的研究，在疾病發(fā)病機理的探討、療效觀察、判斷預后和診斷上都有重要價值，尤其在普查、篩選、早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤方面有重要意義。在治療上，應用胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、 ILγ 干擾素以及多糖類中藥等都可提高紅細胞免疫功能，促進機體恢復正常。制備 LAK細胞有意將紅細胞加入，可提高LAK細胞的產(chǎn)量和活性。從細胞中提取SOD酶，制成商品已應用于抗衰老，增強機體免疫功能上。