【正文】 者包封效率基本無(wú)影響）。 僅考察藥物 類脂比為 1:10 和 2:10 的體外釋放度，其結(jié)果如下圖所示： 0204060801001200 2 4 6 8 10時(shí)間（h）釋放度（%） 圖 44 不同藥物 類脂比對(duì)體外 釋放度的 影響 從圖中可以看出，在相同 PEG 密度的情況下，藥脂比高的樣品釋放慢；相同藥脂比的情況下，高 PEG 密度樣品釋放稍快。從 藥物 釋放的角度 考慮 ， 應(yīng) 該 選擇低 PEG密度，高藥脂比的處方。 不同脂質(zhì)體處方對(duì) 藥代動(dòng)力學(xué) 的影響 為了考察長(zhǎng)春新堿制備成脂質(zhì)體后，是否能達(dá)到預(yù)期目標(biāo) ——延長(zhǎng) 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，其半衰期大于游離藥， 我們 進(jìn)行 了 相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，比較長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體和長(zhǎng)春新堿游離藥在大鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，并為處方篩選提供初步的 體內(nèi) 藥代動(dòng)力學(xué)依據(jù)。 方案設(shè)計(jì) 由于文獻(xiàn)顯示長(zhǎng)春新堿 的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué) 無(wú)性別差異， 因此本實(shí)驗(yàn)選取 Wistar 雄性大鼠，隨機(jī)分成 3 組，分為長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體 A 和 B 組，以及長(zhǎng)春新堿游離藥組，每組 6 只。 給藥劑量均為 1mg/kg，尾靜脈單次推注， 給藥完畢后，將鼠放回鼠籠飼養(yǎng)， 并在規(guī)定的 各時(shí)間點(diǎn)采集血樣 ， 進(jìn)行血藥濃度測(cè)定 。 動(dòng)物及飼養(yǎng) Wistar 雄性大鼠 9 只，體重 180～ 220 g；由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼 21 養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，動(dòng)物自由攝食、飲水，室溫 20～ 24℃ ， 濕度 40%～ 70%，晝夜明暗交替時(shí)間 12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK（冀） 20210046。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料及墊料 均 由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 供試品和對(duì)照品 供試品： 長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體 脂質(zhì)體處方 A B DSPEPEG 藥物 脂質(zhì)比（ D/L） 2:10 2:10 內(nèi)相 磺丁基醚 β環(huán)糊精 三乙胺 含量 / mg/ml 包封率 / % 粒徑 /nm 177。 177。 保存條件 4℃ 保存，避光 對(duì)照品： 長(zhǎng)春新堿原料藥 縮寫(xiě) Free 含量 % 干燥濕重 % 外觀性狀 白色粉末 保存條件 20℃ 避光保存 穩(wěn)定性 24 個(gè)月 批號(hào) 100151 提供單位 廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司 樣品采集 及處理 脂質(zhì)體樣品：受試動(dòng)物于尾靜脈注射給藥前及開(kāi)始給藥后 5min、 24 和 48h 分別從眼眶靜脈叢取血 ml，置肝素抗凝管中， 3000rpm 離心分離血漿，20℃ 凍存?zhèn)溆谩? 游離藥：試動(dòng)物于尾靜脈注射給藥前及開(kāi)始給藥后 1min、 、 5min、 2和 4h分別從眼眶靜脈叢取血 ml，置肝素抗凝管中， 3000rpm 離心分離血漿， 20 ℃凍存?zhèn)溆谩? 長(zhǎng)春新堿在血樣中的濃度通過(guò) HPLC 方法檢測(cè)。 20μl 血樣，加入 460μl 冰水冷卻的甲醇，然后通過(guò)渦旋混勻，在 20℃ 沉淀至少 1 小時(shí)，在 20210g 下離心 10 分鐘。收集上清液進(jìn)行分析檢測(cè)，進(jìn)樣體積為 20μl。 試驗(yàn)結(jié)果 22 0510152025300 5 10 15 20 25 30時(shí)間（h）血藥濃度（ug/ml）free 圖 45 藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果 從圖中可以看出，和長(zhǎng)春新堿游離藥相比，長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體延長(zhǎng)了長(zhǎng) 藥物 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。但兩個(gè) 脂質(zhì)體 處方 、 之間，沒(méi)有明顯 的藥動(dòng)學(xué)上的 差異。 不同脂質(zhì)體處方對(duì)體內(nèi) 毒性 的影響 為了考察長(zhǎng)春新堿制備成脂質(zhì)體 后，是否能達(dá)到預(yù)期 目標(biāo) ——毒性低于游離藥，通過(guò) 毒性試驗(yàn)來(lái)比較 長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體不同處方間和長(zhǎng)春新堿游離藥對(duì)小鼠產(chǎn)生的毒性 作用 。 方案設(shè)計(jì) 文獻(xiàn)資料顯示長(zhǎng)春新堿游離藥單次靜脈給藥對(duì)小鼠的 LD50為 177。 mg/kg。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)起始劑量為 mg/kg，共四個(gè)劑量，即 、 、 和 mg/kg。 挑選健康、體重差異較小的 KM 雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組 5 只小鼠。 分別 單次由 尾靜脈 給予不同量的藥物。 給藥完畢后，將鼠放回鼠籠飼養(yǎng)，并觀察動(dòng)物死亡情況及一般狀態(tài)，每天稱重。觀察周期 14 天。 動(dòng)物及飼養(yǎng) KM 雄性 小鼠， 18～ 22g，購(gòu)于河北省試驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，動(dòng)物自由攝食、飲水，室溫 20～ 25℃ ，濕度 40%～ 70%，晝夜明暗交替時(shí)間 12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK（冀） 20211003，合格證號(hào)： 1206067。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料及墊料 均 由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 23 供試品和對(duì)照品 供試品： 長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體 脂質(zhì)體處方 A B C D DSPEPEG 藥物 脂質(zhì)比（ D/L） 1:10 2:10 1:10 2:10 內(nèi)相 磺丁基醚 β環(huán)糊精 三乙胺 含量 / mg/ml 包封率 / % 粒徑 /nm 177。 177。 177。 177。 保存條件 4℃ 保存，避光 對(duì)照品： 長(zhǎng)春新堿原料藥 縮寫(xiě) Free 含量 % 干燥濕重 % 外觀性狀 白色粉末 保存條件 20℃ 避光保存 穩(wěn)定性 24 個(gè)月 批號(hào) 100151 提供單位 廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限 公司 溶劑： 5%葡萄糖注射液 縮寫(xiě) 5% INJ GS 含量 5% 規(guī)格 100 mL 外觀性狀 無(wú)色透明液體 保存條件 4℃ 保存 穩(wěn)定性 24 個(gè)月 批號(hào) 100323704 提供單位 石家莊四藥有限公司 選擇理由 臨床使用溶劑 試驗(yàn) 內(nèi)容 給藥 根據(jù)不同給藥劑量對(duì)小鼠進(jìn)行單次尾靜脈注射給藥，給藥體積為 20 ml/kg，觀察14 天。 觀察指標(biāo) 一般狀態(tài)觀察：所有動(dòng)物于試驗(yàn)期每天觀察 2 次（給藥當(dāng)天給藥前、后各 1 次，觀察給藥后動(dòng)物反應(yīng)；其它每天上、下午各 1 次），觀察指標(biāo)包括皮膚、被毛、眼、 24 耳、鼻、口腔、胸部、腹部、泌尿生殖部、四肢等部位，以及呼吸、運(yùn)動(dòng)、泌尿、排便和行為改變等。 體重：所有動(dòng)物于試驗(yàn)前稱重 1 次，挑選合適體重動(dòng)物用于試驗(yàn)。給藥后每天固定時(shí)間稱量動(dòng)物體重 1 次 。 死亡和瀕死：死亡動(dòng)物記錄死亡時(shí)間，瀕死動(dòng)物注意增加觀察頻率，確定死亡時(shí)間。 觀察時(shí)間與頻率：試驗(yàn)觀察至給藥后 14 天左右。 評(píng)價(jià)指標(biāo) 最大耐受劑量（ MTD）： 在觀察期內(nèi)，動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)死亡，不可恢復(fù)的毒性反應(yīng)，或者體重減輕 沒(méi)有連續(xù) 3 天 超過(guò) 15%，該劑量即被認(rèn)為是急性單次給藥的最大耐受劑量（ MTD）。 試驗(yàn)結(jié)果 長(zhǎng)春新 堿脂質(zhì)體 多個(gè) 處方和游離藥的 4. 2 和 mg/kg 劑量組均在給藥后第 3 天開(kāi)始出現(xiàn)明顯不良反應(yīng) 。 不良反應(yīng)基本相似，為后肢肌肉強(qiáng)直，無(wú)力，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，而后癱瘓。脂質(zhì)體 A 組和 C 組，以及游離藥 mg/kg 組小鼠也出現(xiàn)后肢肌肉強(qiáng)直，無(wú)力不良反應(yīng)，個(gè)別鼠 發(fā) 現(xiàn)眼瞼下垂和尿道口紅腫現(xiàn)象，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)有所恢復(fù)。 據(jù)動(dòng)物死亡情況和體重減輕大于 15%評(píng)價(jià) MTD，本實(shí)驗(yàn)條件下各研究藥物的MTD 如下： 表 46 長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體 處方 MTD 結(jié)果 脂質(zhì)體處方 A B C D Free DSPEPEG 藥物 脂質(zhì)比（ D/L） 1:10 2:10 1:10 2:10 MTD ＜ ＜ 從毒性試驗(yàn)的結(jié)果，長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體 、 和 三個(gè)處方的最大耐受劑量均大于長(zhǎng)春新堿游離藥，說(shuō)明脂質(zhì)體處方能夠降低長(zhǎng)春新堿的毒性，且處方 的毒性最小。 抗腫瘤活性比較 根據(jù)長(zhǎng)春新堿市售 產(chǎn)品 的適應(yīng)癥，我們選擇白血病 L1210 腹水瘤模型考察不同脂質(zhì)體處方的抗腫瘤活性，以評(píng)價(jià)長(zhǎng)春新堿 長(zhǎng) 循環(huán) 脂質(zhì)體能夠達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量，并為處方篩選提供初步的藥理 學(xué) 依據(jù)。 25 方案設(shè)計(jì) 無(wú)菌條件下抽取 L1 210 腹水細(xì)胞，用生理鹽水稀釋到 107個(gè) 細(xì)胞數(shù) /mL，冰水浴放置備用。每只小鼠腹腔接種 mL，接種完畢后按接種順序均衡分組。 各組 分別靜脈給藥，每次給藥間隔 2 天，連續(xù) 4 次給藥，給藥容積為 20 mL/kg。 劑量設(shè)定依據(jù) 文獻(xiàn) 報(bào)道 長(zhǎng)春新堿 的 臨床成人劑量 1～ 2 mg （或 mg/m2）最大不大于 2 mg；年齡大于 65 歲者，最大每次 1 mg；兒童 mg/m2；每周 1 次靜脈注射或沖入。聯(lián)合化療 是連用 2 周為一周期。 mg/m2換算成小鼠給藥劑量為 mg/kg。 長(zhǎng)春新堿靜脈給予小鼠 的 LD50 為 177。 mg/kg。 預(yù)實(shí)驗(yàn)： ⑴ BALB/c 雌性小鼠，每組 2 只，脂質(zhì)體處方 %PEG， D/L=2。 給藥量 8 mg/kg 組 2 只小鼠在給藥后第 3 天體重減輕＞ 15%，第 4 天死亡。 給藥量 4 mg/kg組 1 只小鼠在給藥后第 10 天體重減輕至 %，而后死亡。另一只小鼠體重減輕最低點(diǎn)在給藥后第 10 天（ %），后逐漸恢復(fù)。 ⑵ BALB/c 雌性小鼠，每組 3 只，脂質(zhì)體處方 %PEG， D/L=2。 給藥量為 mg/kg，給藥 兩次 ，間隔 3 天。脂質(zhì)體組與普通制劑相比對(duì)小鼠毒性無(wú)差異，體重減輕最低點(diǎn)在給藥后 的 第 5 天（ 約 10%），后逐漸恢復(fù)。 劑量設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)定給藥劑量為 ，為求得最佳實(shí)驗(yàn)療效結(jié)果，采用間隔 2 天，連續(xù)靜脈給藥 4 次 。 給藥途徑及給藥途徑選擇理由：靜脈給藥，與臨床給藥方式一致 給藥量：根據(jù)最近一次的體重計(jì)算給藥量。 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：動(dòng)物體重、一般狀況及死亡時(shí)間。 統(tǒng)計(jì)方法：使用生存分析 Survival 的 KaplanMeier 過(guò)程對(duì)生存時(shí)間進(jìn)行組間的兩兩比較。 供試品和對(duì)照品 供試品： 長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體各處方 脂質(zhì)體處方 A B C D DSPEPEG 藥物 脂質(zhì)比（ D/L） 1:10 2:10 1:10 2:10 內(nèi)相 磺丁基醚 β環(huán)糊精 三乙胺 26 含量 / mg/ml 包封率 / % 粒徑 /nm 177。 177。 177。 177。 保存條件 4℃ 保存，避光 對(duì)照品： 長(zhǎng)春新堿原料藥 縮寫(xiě) Free 含量 % 干燥濕重 % 外觀性狀 白色粉末 保存條件 20℃ 避光保存 穩(wěn)定性 24 個(gè)月 批號(hào) 100151 提供單位 廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司 溶劑： 5%葡萄糖注射液 縮寫(xiě) 5% INJ GS 含量 5% 規(guī)格 100 mL 外觀性狀 無(wú)色透明液體 保存條件 4℃ 保存 穩(wěn)定性 24 個(gè)月 批號(hào) 100323704 提供單位 石家莊四藥有限公司 選擇理由 臨床使用溶劑 其他試劑： RPMI 1640 培基（美國(guó) GiBco 公司）；胎牛血清（杭州四季 青）； Trypsin （胰蛋白酶） 1： 250(Sigma 公司 )；白血病 L1210 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。 動(dòng)物及飼養(yǎng) BDF1 雌性小鼠， 78 周，來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，動(dòng)物自由攝食、飲水，室溫 20～ 25℃ ，濕度 40%～ 70%，晝夜明暗交替時(shí)間 12 h/12 h。 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料及墊料 均 由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 試驗(yàn)內(nèi)容 動(dòng)物接種 取體內(nèi)接種傳代 6 天的 L1210 小鼠，斷頸處死，無(wú)菌條件下使用一次性無(wú)菌注射器抽取小鼠腹水，并以生理鹽水稀 釋，顯微鏡計(jì)數(shù)，調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)為 107個(gè)細(xì) 27 胞 /mL，細(xì)胞懸液置于冰水浴。 挑選狀態(tài)良好、體重范圍接近小鼠，按體重進(jìn)行分層（以 1g 為界）用于實(shí)驗(yàn)。 無(wú)菌注射器抽取上述瘤細(xì)胞懸液，注入小鼠腹腔，接種體積為 mL，含瘤細(xì)胞約 106個(gè)，動(dòng)物按照接種時(shí)間先后順序均衡分成 6 組。動(dòng)物組別用記號(hào)筆標(biāo)記于鼠盒上，每組動(dòng)物以苦味酸標(biāo)記于腹部皮毛。 給藥及觀察 接種腫瘤細(xì)胞 24 h 后，分別按組靜脈給藥，給藥容積為 20 mL/kg，多次給藥組據(jù)當(dāng)天體重給予藥物。給藥后動(dòng)物正常飼養(yǎng)，每周測(cè)量鼠重 3 次 ，每天觀察動(dòng) 物一般狀態(tài)，存活情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以動(dòng)物平均生存時(shí)間、中位生存時(shí)間（既 median survival time， MST）和生命延長(zhǎng)率 ILS 來(lái)評(píng)價(jià)藥物的治療效果，生命延長(zhǎng)率公式為 ILS=（給藥組 MST/對(duì)照組 MST1） 100%。實(shí)驗(yàn)觀察至接種后 30 天。 試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示與空白組和長(zhǎng)春新堿游離藥給藥組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各脂質(zhì)體組動(dòng)物體重均顯著下降，除 處方外，其余 3 個(gè)處方治療組動(dòng)物體重下降均大于15%。 小鼠生存時(shí)間采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件 Survival 的 KaplanMeier 過(guò)程進(jìn)行組間生存分析比較，與空白組和等劑量的游離藥相比，各脂質(zhì)體給藥組均顯著延長(zhǎng)動(dòng)物的生存時(shí)間（ P），而 多個(gè) 脂質(zhì)體 處方 給藥組間比較， 動(dòng)物的生存時(shí)間無(wú)顯著性差異。長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體各處方均對(duì)小鼠的生命延長(zhǎng)率 50%。 表 47 動(dòng)物存活天數(shù) 組別 空白