【正文】 操縱子 )不同拷貝數(shù)整合到出發(fā)菌株的染色體 DNA上。 2021/6/21 90 盡管出發(fā)菌株可有效地分泌賴氨酸及少量的丙氨酸，但當(dāng)整合到染色體 DNA 上的 homthrB操縱子的拷貝數(shù)為 1～ 3時(shí)，蘇氨酸的分泌量則顯著增加，同時(shí)賴氨酸的產(chǎn)量則下降了原來(lái)的四分之一。 2021/6/21 91 如果以該蘇氨酸生產(chǎn)菌株作為出發(fā)株 ， 也同樣可采用類似的策略將解除調(diào)節(jié)的蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合成酶 (從蘇氨酸到異亮氨酸的合成途徑的第一和第二個(gè)酶 )引入異亮氨酸的合成途徑 。 2021/6/21 92 以前，此類研究的主要目標(biāo)就是鑒別被認(rèn)為必須改變或繞過(guò)的所謂的 “瓶頸反應(yīng)”。對(duì)于第一步反應(yīng)受到反饋調(diào)節(jié)的某些合成途徑，這一方法的確有效。并且，這一方法是運(yùn)用代謝擷頏物 (如合成途徑的終端產(chǎn)物氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物 )成功地實(shí)現(xiàn)育種策略的基礎(chǔ)。這些代謝擷頏物的抗性突變株的突變，常常是發(fā)生在一個(gè)反饋調(diào)節(jié)的主要反應(yīng)步驟 (一般被叫做“代謝瓶頸” )所對(duì)應(yīng)的基因上。 2021/6/21 93 最典型的例子當(dāng)屬針對(duì)谷氨酸棒桿菌賴氨酸生物合成途徑中的天門(mén)冬氨酸激酶的工作。賴氨酸生產(chǎn)菌種一般是賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物AEC(aminoethyl cystein)的抗性突變株。 2021/6/21 94 然而分子水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，即便是在這種情況下，這種簡(jiǎn)單的方法仍不能導(dǎo)致賴氨酸的高效合成。顯然， 通過(guò)隨機(jī)誘變和篩選所得到的高產(chǎn)菌株，其代謝網(wǎng)絡(luò)已發(fā)生了許多改變 。從很多例子都可推斷， 單單改變某一 “重要的” 步驟 (“瓶頸” )并不一定能實(shí)現(xiàn)氨基酸的過(guò)量合成。 2021/6/21 95 因?yàn)閷?duì)于長(zhǎng)而復(fù)雜的代謝途徑而言 ， 絕對(duì)的單個(gè)限速步驟幾乎是不存在的 。 換言之 ， 整條途徑在代謝網(wǎng)絡(luò)范圍內(nèi)已經(jīng)是調(diào)整好了的 ，“ 分?jǐn)偸降拇x調(diào)控 ” (整條途徑上的代謝調(diào)控實(shí)際上是由許多個(gè)步驟共同分擔(dān) )的發(fā)現(xiàn)也說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題 。這對(duì)于有目的的代謝設(shè)計(jì)是有重要意義的 。 2021/6/21 96 僅僅提高合成途徑的流量往往并不足以將代謝流導(dǎo)向特定氨基酸，實(shí)現(xiàn)特定氨基酸的過(guò)量合成。為了增加氨基酸的生產(chǎn)， 增加關(guān)鍵前體物的供應(yīng)量也是十分重要的 。 2021/6/21 97 關(guān)鍵前體物的供應(yīng) 可通過(guò)中間代謝的反應(yīng) (如 TCA環(huán)的回補(bǔ)反應(yīng)支持 TCA 環(huán)中間產(chǎn)物的供應(yīng)、EMP途徑和 HMP途徑分別為芳香族氨基酸的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和 4磷酸赤蘚糖 )，或者在培養(yǎng)基中額外添加特定前體物供微生物細(xì)胞吸收和利用。 2021/6/21 98 當(dāng)對(duì)合成途徑進(jìn)行修飾或?qū)驎r(shí)，中心代謝途徑的反應(yīng)出乎意料地成了限制因素；這一點(diǎn)再次強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞代謝通常已得到有效的調(diào)節(jié)，這也就意味著 許多不同反應(yīng)之間的最佳平衡和秩序井然的分?jǐn)偸娇刂聘采w了代謝網(wǎng)絡(luò)的大部分。只有當(dāng)合理延伸的代謝網(wǎng)絡(luò)片段以一種協(xié)調(diào)的方式得到有目的的改變時(shí)，代謝流大規(guī)模的導(dǎo)向才能最終導(dǎo)致最優(yōu)的結(jié)果。 2021/6/21 99 總體來(lái)說(shuō)，副產(chǎn)物的形成可以通過(guò)兩種策略來(lái)避免： 2021/6/21 100 最有利的方法是充分地調(diào)動(dòng)所研究的途徑，這樣就不會(huì)形成大量通往副產(chǎn)物的中間產(chǎn)物了；另一種方法是使從目的氨基酸的合成途徑分出通往副產(chǎn)物合成的分支的第一個(gè)酶失活。前文所述的在生產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌菌株中，去除色氨酸酶，就是這一策略的一個(gè)成功應(yīng)用；這樣就堵死了色氨酸過(guò)量合成條件下色氨酸的主要消耗。 2021/6/21 101 當(dāng)引入新的途徑或者改變已建立的代謝途徑上代謝流的流向時(shí)，除了要考慮碳架流，還考慮氧化還原平衡和代謝能平衡。 2021/6/21 102 對(duì)氨基酸產(chǎn)生菌的代謝途徑的大規(guī)模導(dǎo)向會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。實(shí)際上，一般氨基酸的分泌，特別是 谷氨酸棒桿菌中谷氨酸的分泌被解釋為氧化還原作用失去平衡的結(jié)果 ，谷氨酸的分泌在供氧條件的試驗(yàn)過(guò)程中，觀察到一個(gè)明顯最佳狀態(tài)。 2021/6/21 103 在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)賴氨酸或谷氨酸的條件下，不僅碳架流會(huì)發(fā)生較大的變化，糖酵解途徑(產(chǎn)生 NADH)和磷酸戊糖途徑 (產(chǎn)生 NADPH)間的 流量分配 也必定會(huì)發(fā)生巨大的變化 。 2021/6/21 104 此外， 從理論上推測(cè)谷氨酸棒桿菌賴氨酸最大產(chǎn)量的獲得在很大程度上依賴于細(xì)胞的 NADPH 的水平。 然而，曾嘗試過(guò)確定賴氨酸生產(chǎn)條件下 NADPH的真實(shí)化學(xué)計(jì)量，并嘗試將其同其他合成反應(yīng)進(jìn)行比較，結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn) NADPH 是大大過(guò)量的，這一點(diǎn)至今還無(wú)法解釋。 2021/6/21 105 這些結(jié)果再次強(qiáng)調(diào)還原力定量分析的重要性，其對(duì)于氨基酸生產(chǎn)菌株總體流量的進(jìn)一步優(yōu)化，也具有潛在的重要性。 2021/6/21 106 關(guān)于代謝能平衡的量化問(wèn)題，就目前而言，幾乎還是空白。在氨基酸生產(chǎn)方面，因?yàn)殛P(guān)于還原力平衡的問(wèn)題已有一些討論，能量平衡問(wèn)題就常常被忽略。 2021/6/21 107 除了 ATP的形成過(guò)程和已知的ATP消耗過(guò)程之間的不平衡，氨基酸過(guò)量合成顯然遠(yuǎn)非僅僅與能量的輸入和輸出的“偶聯(lián)”或“贏利”。如上所述， 代謝能的重大消耗一般都能觀察到，這種損耗一方面甚至?xí)拗飘a(chǎn)物對(duì)基質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，另一方面也可能是增加特定產(chǎn)物分泌的基礎(chǔ)。 2021/6/21 108 氨基酸的過(guò)量生產(chǎn)可由兩種不同的代謝狀態(tài)引起。諸如賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸及芳香族氨基酸等可通過(guò)解除合成途徑的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)量分泌；而谷氨酸的分泌在許多細(xì)菌中則是對(duì)環(huán)境壓力的響應(yīng)。因此，如上所述，這兩種情況下的研究策略也是不同的。 2021/6/21 109 要改善氨基酸的生產(chǎn)，除了碳架流方面以外，在還原力控制和能量代謝方面還有很多工作等待著我們?nèi)プ觥? 2021/6/21 110 目前的研究越來(lái)越多地把興趣放在跨膜輸送反應(yīng)上，包括對(duì)可能限制氨基酸生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)因子的吸收，以及作為工藝控制中重要一步的終端產(chǎn)物的分泌。 2021/6/21 111 氨基酸分泌系統(tǒng)的存在，以及其生理重要性，直到最近才得到闡明。這為氨基酸生產(chǎn)菌株的改良開(kāi)創(chuàng)了一塊全新的領(lǐng)域。 這一研究方向可納入目前的研究熱點(diǎn)，也就是對(duì)各種反應(yīng)進(jìn)行流量分析，包括底物吸收、中心代謝途徑、合成途徑，以及產(chǎn)物輸出。 2021/6/21 112 在這些分析中，我們將實(shí)現(xiàn)概念上的轉(zhuǎn)變，也就是從描述性數(shù)據(jù) ——例如細(xì)胞抽提物中有關(guān)酶的活力或底物、產(chǎn)物和副產(chǎn)物濃度的測(cè)定 ——到穩(wěn)態(tài)流量數(shù)據(jù)的分析和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的描繪的轉(zhuǎn)變。這就意味著 要研究流量的分布、指定的網(wǎng)絡(luò)、被微調(diào)的酶在代謝網(wǎng)絡(luò)中活性的微妙的變化。 2021/6/21 113 為了了解原始生理背景下的代謝反應(yīng)，以及在正常條件下這些反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的重要性，還要求實(shí)現(xiàn)另一個(gè)轉(zhuǎn)變，也就是 由對(duì)微生物細(xì)胞輸入和輸出的平衡數(shù)據(jù)的測(cè)定和采集（測(cè)定細(xì)胞外培養(yǎng)基中的濃度），轉(zhuǎn)變?yōu)楂@取胞內(nèi)的定量信息。 2021/6/21 114 當(dāng)然，這同時(shí)也意味著需要有新的分析方法。胞外和胞內(nèi)代謝物濃度的區(qū)別應(yīng)該是可靠的，這需要靠有效的終止步驟來(lái)實(shí)現(xiàn) 胞內(nèi)外組分快速和定量的分離 、也需要靈敏的分析方法來(lái)測(cè)定盡可能多的 胞內(nèi)代謝物 。 2021/6/21 115 目前研究的另一方面是，將大腸桿菌和釀酒酵母中已經(jīng)非常成熟的分子生物學(xué)工具，應(yīng)用到工業(yè)微生物尤其是格蘭氏陽(yáng)性菌中，如谷氨酸棒桿菌。 遺傳的成功改造通常會(huì)受到異種 DNA引起的重排和丟失的限制，以及細(xì)胞的有效的制約系統(tǒng)的限制。 2021/6/21 116 近年谷氨酸棒桿菌基因工程的一些主要工具已經(jīng)構(gòu)建。前幾年開(kāi)始研究一種可靠的轉(zhuǎn)座子誘變，這種重要的工具在谷氨酸棒桿菌中仍未建立起來(lái)。 2021/6/21 117 傳統(tǒng)的菌種改良方法同現(xiàn)代“ 代謝設(shè)計(jì) ”方法相比較，在許多方面仍具有競(jìng)爭(zhēng)力。但隨著我們對(duì)代謝及分子遺傳學(xué)工具等方面認(rèn)識(shí)的加深，有目的的代謝設(shè)計(jì)必然成為菌種改良的主要方法。 在詳細(xì)地了解細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)及代謝調(diào)控的基礎(chǔ)上，代謝途徑的構(gòu)建和代謝流的導(dǎo)向都將成為現(xiàn)實(shí)。 2021/6/21 118 從以下三個(gè)方面分析： ； ； 。 根據(jù)細(xì)胞經(jīng)濟(jì)假設(shè)靈活應(yīng)用五字策略 AAs 2021/6/21 119 啤酒酵母釀造啤酒的代謝亞網(wǎng)絡(luò) 2021/6/21 120 與其愁，不如做。做中學(xué)，學(xué)中做。勤總結(jié)，常修正。心要平，步要穩(wěn)。目標(biāo)明，事必成。