【正文】 操縱子 )不同拷貝數整合到出發(fā)菌株的染色體 DNA上。 2021/6/21 90 盡管出發(fā)菌株可有效地分泌賴氨酸及少量的丙氨酸，但當整合到染色體 DNA 上的 homthrB操縱子的拷貝數為 1～ 3時，蘇氨酸的分泌量則顯著增加，同時賴氨酸的產量則下降了原來的四分之一。 2021/6/21 91 如果以該蘇氨酸生產菌株作為出發(fā)株 ， 也同樣可采用類似的策略將解除調節(jié)的蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合成酶 (從蘇氨酸到異亮氨酸的合成途徑的第一和第二個酶 )引入異亮氨酸的合成途徑 。 2021/6/21 92 以前，此類研究的主要目標就是鑒別被認為必須改變或繞過的所謂的 “瓶頸反應”。對于第一步反應受到反饋調節(jié)的某些合成途徑，這一方法的確有效。并且，這一方法是運用代謝擷頏物 (如合成途徑的終端產物氨基酸的結構類似物 )成功地實現育種策略的基礎。這些代謝擷頏物的抗性突變株的突變，常常是發(fā)生在一個反饋調節(jié)的主要反應步驟 (一般被叫做“代謝瓶頸” )所對應的基因上。 2021/6/21 93 最典型的例子當屬針對谷氨酸棒桿菌賴氨酸生物合成途徑中的天門冬氨酸激酶的工作。賴氨酸生產菌種一般是賴氨酸的結構類似物AEC(aminoethyl cystein)的抗性突變株。 2021/6/21 94 然而分子水平的實驗證實，即便是在這種情況下，這種簡單的方法仍不能導致賴氨酸的高效合成。顯然， 通過隨機誘變和篩選所得到的高產菌株，其代謝網絡已發(fā)生了許多改變 。從很多例子都可推斷， 單單改變某一 “重要的” 步驟 (“瓶頸” )并不一定能實現氨基酸的過量合成。 2021/6/21 95 因為對于長而復雜的代謝途徑而言 ， 絕對的單個限速步驟幾乎是不存在的 。 換言之 ， 整條途徑在代謝網絡范圍內已經是調整好了的 ，“ 分攤式的代謝調控 ” (整條途徑上的代謝調控實際上是由許多個步驟共同分擔 )的發(fā)現也說明了這個問題 。這對于有目的的代謝設計是有重要意義的 。 2021/6/21 96 僅僅提高合成途徑的流量往往并不足以將代謝流導向特定氨基酸，實現特定氨基酸的過量合成。為了增加氨基酸的生產， 增加關鍵前體物的供應量也是十分重要的 。 2021/6/21 97 關鍵前體物的供應 可通過中間代謝的反應 (如 TCA環(huán)的回補反應支持 TCA 環(huán)中間產物的供應、EMP途徑和 HMP途徑分別為芳香族氨基酸的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和 4磷酸赤蘚糖 )，或者在培養(yǎng)基中額外添加特定前體物供微生物細胞吸收和利用。 2021/6/21 98 當對合成途徑進行修飾或導向時，中心代謝途徑的反應出乎意料地成了限制因素；這一點再次強調了細胞代謝通常已得到有效的調節(jié)，這也就意味著 許多不同反應之間的最佳平衡和秩序井然的分攤式控制覆蓋了代謝網絡的大部分。只有當合理延伸的代謝網絡片段以一種協(xié)調的方式得到有目的的改變時，代謝流大規(guī)模的導向才能最終導致最優(yōu)的結果。 2021/6/21 99 總體來說，副產物的形成可以通過兩種策略來避免： 2021/6/21 100 最有利的方法是充分地調動所研究的途徑，這樣就不會形成大量通往副產物的中間產物了；另一種方法是使從目的氨基酸的合成途徑分出通往副產物合成的分支的第一個酶失活。前文所述的在生產色氨酸的大腸桿菌菌株中，去除色氨酸酶，就是這一策略的一個成功應用；這樣就堵死了色氨酸過量合成條件下色氨酸的主要消耗。 2021/6/21 101 當引入新的途徑或者改變已建立的代謝途徑上代謝流的流向時，除了要考慮碳架流，還考慮氧化還原平衡和代謝能平衡。 2021/6/21 102 對氨基酸產生菌的代謝途徑的大規(guī)模導向會出現一些問題。實際上，一般氨基酸的分泌，特別是 谷氨酸棒桿菌中谷氨酸的分泌被解釋為氧化還原作用失去平衡的結果 ，谷氨酸的分泌在供氧條件的試驗過程中，觀察到一個明顯最佳狀態(tài)。 2021/6/21 103 在谷氨酸棒桿菌生產賴氨酸或谷氨酸的條件下，不僅碳架流會發(fā)生較大的變化，糖酵解途徑(產生 NADH)和磷酸戊糖途徑 (產生 NADPH)間的 流量分配 也必定會發(fā)生巨大的變化 。 2021/6/21 104 此外， 從理論上推測谷氨酸棒桿菌賴氨酸最大產量的獲得在很大程度上依賴于細胞的 NADPH 的水平。 然而，曾嘗試過確定賴氨酸生產條件下 NADPH的真實化學計量，并嘗試將其同其他合成反應進行比較，結果驚奇地發(fā)現 NADPH 是大大過量的，這一點至今還無法解釋。 2021/6/21 105 這些結果再次強調還原力定量分析的重要性，其對于氨基酸生產菌株總體流量的進一步優(yōu)化，也具有潛在的重要性。 2021/6/21 106 關于代謝能平衡的量化問題，就目前而言，幾乎還是空白。在氨基酸生產方面，因為關于還原力平衡的問題已有一些討論，能量平衡問題就常常被忽略。 2021/6/21 107 除了 ATP的形成過程和已知的ATP消耗過程之間的不平衡，氨基酸過量合成顯然遠非僅僅與能量的輸入和輸出的“偶聯”或“贏利”。如上所述， 代謝能的重大消耗一般都能觀察到，這種損耗一方面甚至會限制產物對基質的轉化率，另一方面也可能是增加特定產物分泌的基礎。 2021/6/21 108 氨基酸的過量生產可由兩種不同的代謝狀態(tài)引起。諸如賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸及芳香族氨基酸等可通過解除合成途徑的調節(jié)來實現過量分泌；而谷氨酸的分泌在許多細菌中則是對環(huán)境壓力的響應。因此，如上所述，這兩種情況下的研究策略也是不同的。 2021/6/21 109 要改善氨基酸的生產，除了碳架流方面以外，在還原力控制和能量代謝方面還有很多工作等待著我們去做。 2021/6/21 110 目前的研究越來越多地把興趣放在跨膜輸送反應上，包括對可能限制氨基酸生產的營養(yǎng)因子的吸收，以及作為工藝控制中重要一步的終端產物的分泌。 2021/6/21 111 氨基酸分泌系統(tǒng)的存在，以及其生理重要性，直到最近才得到闡明。這為氨基酸生產菌株的改良開創(chuàng)了一塊全新的領域。 這一研究方向可納入目前的研究熱點，也就是對各種反應進行流量分析，包括底物吸收、中心代謝途徑、合成途徑，以及產物輸出。 2021/6/21 112 在這些分析中，我們將實現概念上的轉變，也就是從描述性數據 ——例如細胞抽提物中有關酶的活力或底物、產物和副產物濃度的測定 ——到穩(wěn)態(tài)流量數據的分析和動力學性質的描繪的轉變。這就意味著 要研究流量的分布、指定的網絡、被微調的酶在代謝網絡中活性的微妙的變化。 2021/6/21 113 為了了解原始生理背景下的代謝反應，以及在正常條件下這些反應對細胞的重要性，還要求實現另一個轉變，也就是 由對微生物細胞輸入和輸出的平衡數據的測定和采集（測定細胞外培養(yǎng)基中的濃度），轉變?yōu)楂@取胞內的定量信息。 2021/6/21 114 當然，這同時也意味著需要有新的分析方法。胞外和胞內代謝物濃度的區(qū)別應該是可靠的，這需要靠有效的終止步驟來實現 胞內外組分快速和定量的分離 、也需要靈敏的分析方法來測定盡可能多的 胞內代謝物 。 2021/6/21 115 目前研究的另一方面是，將大腸桿菌和釀酒酵母中已經非常成熟的分子生物學工具，應用到工業(yè)微生物尤其是格蘭氏陽性菌中，如谷氨酸棒桿菌。 遺傳的成功改造通常會受到異種 DNA引起的重排和丟失的限制，以及細胞的有效的制約系統(tǒng)的限制。 2021/6/21 116 近年谷氨酸棒桿菌基因工程的一些主要工具已經構建。前幾年開始研究一種可靠的轉座子誘變，這種重要的工具在谷氨酸棒桿菌中仍未建立起來。 2021/6/21 117 傳統(tǒng)的菌種改良方法同現代“ 代謝設計 ”方法相比較，在許多方面仍具有競爭力。但隨著我們對代謝及分子遺傳學工具等方面認識的加深，有目的的代謝設計必然成為菌種改良的主要方法。 在詳細地了解細胞的代謝網絡及代謝調控的基礎上，代謝途徑的構建和代謝流的導向都將成為現實。 2021/6/21 118 從以下三個方面分析： ； ； 。 根據細胞經濟假設靈活應用五字策略 AAs 2021/6/21 119 啤酒酵母釀造啤酒的代謝亞網絡 2021/6/21 120 與其愁，不如做。做中學，學中做。勤總結，常修正。心要平，步要穩(wěn)。目標明，事必成。