【正文】 統(tǒng) 跨膜吸收 碳架、還原力、代謝能 跨膜輸出 重吸收 反饋 調(diào)節(jié) 圖 1. 微生物細(xì)胞合成氨基酸的相關(guān)途徑及代謝調(diào)節(jié)示意圖 其中，各相關(guān)酶及途徑水平上的代謝調(diào)節(jié)，以及整個(gè)細(xì)胞水平上的全局調(diào)節(jié)對(duì)于代謝流的導(dǎo)向和改造是至關(guān)重要的。該途徑上主要調(diào)控點(diǎn)是天冬氨酸激酶(AK)， 其他重要的酶包括高絲氨酸脫氫酶 (HDH)和蘇氨酸脫氫酶 (TDH)。 2021/6/21 21 另一個(gè)重要的方面是參與特定氨基酸合成途徑及與之相關(guān)的其他代謝途徑的 酶的調(diào)節(jié)特性 ，包括酶活力的調(diào)節(jié)和酶的表達(dá)的調(diào)節(jié)。 這一方面是因?yàn)樗鼈冊(cè)谶@些條件下可能不穩(wěn)定；另一方面，對(duì)于需要什么樣的輔因子才能保持它們的活性或 (和 )它們?cè)诰彌_液中的穩(wěn)定性，也知之甚少；而且特別是因?yàn)樵诔樘岬倪^(guò)程中，那些參與胞內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)的必需因子會(huì)丟失。 后來(lái)才弄清這個(gè)酶在谷氨酸棒桿菌中實(shí)際上是存在的，但是它似乎很不穩(wěn)定 。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)的復(fù)合模式就是最好的例子。丙酮酸羧化酶 (PC)的存在已得到代謝流量分析的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。中心代謝途徑和合成代謝途徑，特別是合成代謝途徑，同全局調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)，如緊縮控制、營(yíng)養(yǎng)阻遏、供氧控制、氮源調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)及生長(zhǎng)階段調(diào)節(jié)等。 2021/6/21 33 (其中 表示反饋抑制； 表示反饋?zhàn)瓒?) 圖 3 天冬族氨基酸過(guò)量合成的機(jī)理 I R PYR AcCoA OAA TCA CTA HDH hom DDPS dap A Asp AspP AK lys C ASA Hse Met DDP SucAKPA DAP Lys HK thr B Ile Thr TDH ilv A AHAS ilv BN Thr Lys Thr Met R Met Ile,Leu,Val Ile Ile EMP PEP PPC PCK PC ODC PK PPS Glc G6P PTS 比如圖 3 中，谷氨酸棒桿菌中高絲氨酸缺陷或蘇氨酸缺陷的賴氨酸生產(chǎn)菌株，大腸桿菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或異亮氨酸缺陷的蘇氨酸生產(chǎn)菌株。 2021/6/21 36 然而，對(duì)于與生長(zhǎng)限制相關(guān)的中心代謝 (central metabolism)和外圍代謝(peripheral metabolism)的改變?nèi)绾斡绊懓被岬挠行?，還不很清楚；這或許與影響到許多不同的基因和操縱子的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò) (regulatory works)的作用有關(guān)。 2021/6/21 39 谷氨酸的分泌曾被認(rèn)為是因?yàn)橄鄬?duì)簡(jiǎn)單和直接的代謝改變（即影響細(xì)胞膜性質(zhì)）的而引起的，然而最近發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有緊縮效應(yīng)的大腸桿菌（ rel A 基因缺損）中，通過(guò)氨基酸饑餓法可以觸發(fā)細(xì)胞借助于載體的谷氨酸分泌活性，這表明全局調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)分泌的影響是存在的。 2021/6/21 41 （ 1） 氨基酸的生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)之間的關(guān)系尚未解決（耦合與否？）。 2021/6/21 43 （ 3）溢出代謝的概念：當(dāng)這個(gè)生理學(xué)的新見(jiàn)識(shí)同過(guò)量生產(chǎn)的特定代謝條件，在分子水平上發(fā)生相互關(guān)聯(lián)的時(shí)候，溢出代謝 (overflow metabolism)的概念是值得關(guān)注的。代謝不平衡的條件常常涉及到 溢流閥 (overflow valves)的功能。然而，對(duì)特定條件下(如與不生長(zhǎng)發(fā)生耦合或耦合欠佳的氨基酸的生產(chǎn)條件下 )代謝能耗散的機(jī)制，尚待進(jìn)行深入的研究。 2021/6/21 48 其實(shí)，關(guān)于谷氨酸棒桿菌的賴氨酸生產(chǎn)的能量溢出問(wèn)題已有過(guò)爭(zhēng)論，賴氨酸生產(chǎn)的最大轉(zhuǎn)化率可能受到過(guò)量的代謝能的約束。細(xì)胞外部滲透壓 (實(shí)際上是水活度 )的改變不但對(duì)細(xì)胞的代謝，而且對(duì)底物的吸收、產(chǎn)物的釋放都會(huì)產(chǎn)生有效的影響。代謝流量分析和代謝流的動(dòng)力學(xué)分析的一個(gè)主要目的在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)為的限速步驟。其基本原理就是分析酶活力或酶濃度的微量變化對(duì)代謝流量及代謝物濃度的影響，進(jìn)而確定特定的流量控制系數(shù) (flux control coefficients)， 該系數(shù)反映特定反應(yīng)對(duì)復(fù)雜途徑的影響程度。如果所研究的代謝網(wǎng)絡(luò)的途徑結(jié)構(gòu)已知，又假定進(jìn)行穩(wěn)態(tài)代謝，那么就可通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)得的所有進(jìn)出細(xì)胞代謝流的流量，推導(dǎo)出特定途徑的代謝流量分布。 2021/6/21 59 如采用示蹤流量實(shí)驗(yàn) (tracer flux experiments)技術(shù)、快速取樣技術(shù)及核磁共振 (NMR)技術(shù)可獲得關(guān)于代謝流分布的另外一些信息，如代謝網(wǎng)絡(luò)的有關(guān)組成部分中的流量分布、胞內(nèi)不同代謝產(chǎn)物的累積量，以及它們各自隨時(shí)間而變化的情況。在氨基酸分泌的情況下，回補(bǔ)反應(yīng)變得更重要一些。對(duì)于某些細(xì)菌，特別是大腸桿菌對(duì)底物吸收的不同機(jī)制已作了詳盡的研究，但對(duì)于其它生物工程有關(guān)的微生物，如谷氨酸棒桿菌的蔗糖及羧酸的吸收機(jī)制則知之甚少。而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)的重組菌株中，丙氨酸則是依靠簡(jiǎn)單擴(kuò)散機(jī)制來(lái)分泌。 2021/6/21 69 下圖顯示了谷氨酸棒桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的不同流量。 2021/6/21 73 一般說(shuō)來(lái)，抵消氨基酸的產(chǎn)量的氨基酸的吸收系統(tǒng)對(duì)于整個(gè)過(guò)程并不重要。 2021/6/21 74 在進(jìn)行包括輸送途徑的代謝流量的詳細(xì)分析時(shí)，特別是在比較野生株和生產(chǎn)菌株，或特定菌株在生產(chǎn)或非生產(chǎn)條件下的性質(zhì)時(shí)，已引出了幾個(gè)重要的概念。只有當(dāng)一系列酶發(fā)生了協(xié)調(diào)的改變，才能避免細(xì)胞內(nèi)代謝中間產(chǎn)物庫(kù)的虧空或積壓，避免代謝不平衡或不必要的副反應(yīng) 。 2021/6/21 78 HMP EMP PEP E4P DAHP 莽草酸 分支酸 預(yù)苯酸 鄰氨基苯甲酸 Phe Tyr Trp PRPP Ser 降解產(chǎn)物 大腸桿菌中色氨酸合成途徑的簡(jiǎn)圖 該圖略去了酶活力及基因表達(dá)水平上的調(diào)控機(jī)制，實(shí)際上在生產(chǎn)菌株中，這些調(diào)控機(jī)制都已被解除。 這個(gè)發(fā)現(xiàn)為許多途徑中 的 關(guān) 于 “ 分 攤 式 的 代 謝 控 制（ distributive metabolic control） ”的更加籠統(tǒng)的描述提供了支持；同時(shí)也 對(duì)仍在廣泛使用的代謝途徑的所謂 “ 瓶頸 ” 識(shí)別方法做出了一個(gè)重要的限制 。然而，利用腸道細(xì)菌進(jìn)行氨基酸菌種的育種的優(yōu)勢(shì)則在于可以方便地應(yīng)用成熟的現(xiàn)代 DNA 重組技術(shù)，有效地進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)菌種的改造。 2021/6/21 85 這些對(duì)關(guān)鍵酶的活性或調(diào)節(jié)機(jī)制的改良可大大增加最終要被分泌的終端產(chǎn)物氨 基酸的胞內(nèi)濃度。 2021/6/21 88 二十多年前，曾有人做過(guò)把谷氨酸棒桿菌中碳架流導(dǎo)向蘇氨酸的開(kāi)創(chuàng)性研究，其方法是擴(kuò)增蘇氨酸合成途徑起始端的兩個(gè)酶高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶的基因 (hom 和 thrB)， 以及解除對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋調(diào)節(jié)。 2021/6/21 92 以前，此類研究的主要目標(biāo)就是鑒別被認(rèn)為必須改變或繞過(guò)的所謂的 “瓶頸反應(yīng)”。 2021/6/21 93 最典型的例子當(dāng)屬針對(duì)谷氨酸棒桿菌賴氨酸生物合成途徑中的天門(mén)冬氨酸激酶的工作。從很多例子都可推斷， 單單改變某一 “重要的” 步驟 (“瓶頸” )并不一定能實(shí)現(xiàn)氨基酸的過(guò)量合成。 2021/6/21 96 僅僅提高合成途徑的流量往往并不足以將代謝流導(dǎo)向特定氨基酸，實(shí)現(xiàn)特定氨基酸的過(guò)量合成。只有當(dāng)合理延伸的代謝網(wǎng)絡(luò)片段以一種協(xié)調(diào)的方式得到有目的的改變時(shí)，代謝流大規(guī)模的導(dǎo)向才能最終導(dǎo)致最優(yōu)的結(jié)果。 2021/6/21 102 對(duì)氨基酸產(chǎn)生菌的代謝途徑的大規(guī)模導(dǎo)向會(huì)出現(xiàn)一些問(wèn)題。 然而，曾嘗試過(guò)確定賴氨酸生產(chǎn)條件下 NADPH的真實(shí)化學(xué)計(jì)量，并嘗試將其同其他合成反應(yīng)進(jìn)行比較，結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn) NADPH 是大大過(guò)量的，這一點(diǎn)至今還無(wú)法解釋。 2021/6/21 107 除了 ATP的形成過(guò)程和已知的ATP消耗過(guò)程之間的不平衡，氨基酸過(guò)量合成顯然遠(yuǎn)非僅僅與能量的輸入和輸出的“偶聯(lián)”或“贏利”。因此，如上所述，這兩種情況下的研究策略也是不同的。這為氨基酸生產(chǎn)菌株的改良開(kāi)創(chuàng)了一塊全新的領(lǐng)域。 2021/6/21 113 為了了解原始生理背景下的代謝反應(yīng)，以及在正常條件下這些反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的重要性，還要求實(shí)現(xiàn)另一個(gè)轉(zhuǎn)變，也就是 由對(duì)微生物細(xì)胞輸入和輸出的平衡數(shù)據(jù)的測(cè)定和采集（測(cè)定細(xì)胞外培養(yǎng)基中的濃度），轉(zhuǎn)變?yōu)楂@取胞內(nèi)的定量信息。 遺傳的成功改造通常會(huì)受到異種 DNA引起的重排和丟失的限制，以及細(xì)胞的有效的制約系統(tǒng)的限制。但隨著我們對(duì)代謝及分子遺傳學(xué)工具等方面認(rèn)識(shí)的加深，有目的的代謝設(shè)計(jì)必然成為菌種改良的主要方法。做中學(xué)，學(xué)中做。