【正文】 Time (min) 1 2 3 4 5 6 0 Time (min) 1 2 3 4 5 6 色譜柱 : ZORBAX Eclipse XDBC8 x 150 mm, 5 um 流動相 : 40% 磷酸鹽緩沖液 60% ACN 流速 : mL/min. 溫度 : 40176。 C USP Tf 10 mM 磷酸鹽 pH USP Tf 25 mM 磷酸鹽 pH ? 在中等 pH下 , 離子強度較高 , 能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾 隨緩沖鹽濃度 升高， Rt降低 流動相 pH值的選擇 ? 酸性分析物： pH≤pKa ? 單一堿性分析物： pH≤ 或 pH≥pKa+2 ? 復雜堿性混合物： pH≥pKa+2 反相 HPLC常用緩沖液 緩沖液 pKa pH范圍 磷酸鹽 pK1 ~ 檸檬酸鹽 pK1 ~ 甲酸鹽 ~ 檸檬酸鹽 pK2 ~ 乙酸鹽 ~ 檸檬酸鹽 pK3 ~ 磷酸鹽 pK2 ~ 羥甲基甲胺 ~ 氨 ~ 硼酸鹽 ~ 甘氨酸 ~ 1甲基 哌啶 ~ 四氫化吡咯 ~ 二乙胺 ~ 三乙胺 ~ 磷酸鹽 pK3 ~ 緩沖液的一般 有效緩沖范圍 為 PK177。 1pH。 三乙胺 對堿性成分峰形的影響 0 Time (min) 1 2 3 4 5 色譜柱 : ZORBAX Eclipse XDBC8, x 150 mm, 5 mm 流動相 : 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN 流速 : mL/min. 溫度 : 35176。 C USP TF 5% 1. 2. 3. 4. 5. No TEA 10 mM TEA USP TF 5% 1. 2. 3. 4. 5. Time (min) 3 5 4 2 1 樣品 : 1. 去甲麻黃堿 2. 麻黃素 3. 苯丙胺 4. 脫氧麻黃堿 5. 苯丁胺 酸對酸性組分的峰形的影響 色譜柱 :ZORBAX StableBond SBC18 x 150 mm, 5 mm 流動相 : 40% A: 60% ACN 流速 : mL/min. 溫度 : 室溫 樣品 : 異丁苯丙酸， pKa pH 3 5 mM NaH2PO4 Tf = pH 3 5 mM NaH2PO4 1% 乙酸 pH % 三氟乙酸 Tf = Tf = A: ? 乙酸和三氟乙酸均能作為酸填加至流動相中 ? 三氟乙酸由于所需濃度較低 , 可作為首選 柱容量對峰型的影響 mm overloaded mm overloaded mm 液相色譜柱 : ZORBAX Eclipse XDBC18 色譜柱尺寸 : x 250 mm 5181。m UV: 254 nm 流速 : 1 mL/ min. te 甲酸酯 刻度混合 : 比例閥 A: 水 B: 甲醇 , 用泵抽取 50% B 體積比混合 : V/V 250 mL水 + 250 mL甲醇 , 用泵抽取 100%混合液 定容混合 : 250 mL甲醇 , 用水定容至 500 mL, 用泵抽取 100%混合液 重量比混合 : (w/w) 200 g甲醇 + 200 g水 , 用泵抽取 100%混合液 流動相配比的影響 等度和梯度的影響 色譜柱： Dionex acclaim C18， 250* ， 柱溫 ： 25℃ ， 波長 ： 203nm 流速 ： 樣品：人參皂苷 Rg1 ：乙腈：水（ 22： 78）為流動相 ：乙腈：水為流動相 0min 20 : 80 20min 40 : 60 等度和梯度獲得柱效不同 mi n0 5 10 15 20 25N o r m.050100150200250 D A D 1 A , S i g = 2 0 3 , 4 R e f = 3 6 0 , 1 0 0 ( B U X I N Q I \ K F 0 0 0 0 0 1 . D )14.538mi n0 5 10 15 20 25N o r m.050100150200250 D A D 1 A , S i g = 2 0 3 , 4 R e f = 3 6 0 , 1 0 0 ( B U X I N Q I \ K F 0 0 0 0 0 9 . D )1 0 .8 3 8柱效 柱效 6萬 液相色譜柱的應用 六、色譜柱的維護 色譜柱的保存 系統(tǒng)及填料 儲存溶劑 正相系統(tǒng) (SiO2,CN,NH2) 正己烷 反相系統(tǒng) (C18,C8,C4,C6H6) 純甲醇或純乙腈 特殊填料 (手性 ,專用柱 ) 按說明書規(guī)定要求 色譜柱的保存 ?短期不用必須沖洗干凈后保存 . ?長期不用每隔 2~3個月沖洗一次 ?防止碰撞和強烈振動 色譜柱的維護保養(yǎng) ? 購買新柱后一定要仔細閱讀說明書，確認柱的使用條件以及 清洗再生步驟，按照說明書條件測試色譜柱柱效，記錄使用壓力 ? ?? 定期檢測柱壓和柱效 ? ?? 不同流動相之間轉換時應注意溶劑的互溶性 ? ?? 確認樣品不會在流動相中析出或帶有固體不溶物，請使用 ，或者進行前處理。 ? ?? 為了延長色譜柱使用壽命，請使用保護柱。 ? ?? 定期用合適的溶劑清洗或再生色譜柱 ? ?? 長期不用時，清洗干凈后，使用柱子說明書中指明的溶劑保 存。柱子要從儀器上卸下并用堵頭密封后保存。 ? ?? 定期用合適的流動相清洗保存的柱子，避免干涸。 色譜柱易出現的問題 ? 譜圖分叉 柱頭塌陷 ? 修 補 前后 現 象 1 3 2 1 3 2 樣 品 問題 2 4 3 1 常 見問題 及解 決 方法 現 象 原 因 解決辦法 峰型不好（分叉、拖尾、前伸） 柱頭塌陷、保護柱和柱子不匹配、污染 見資料 壓力升高 管路、保護柱、柱子堵塞 見資料 壓力過低 漏液 氣泡 見資料 壓力波動 氣泡 見資料 資料 色譜柱子污染對比 ? 正常 污染后 色譜柱的修復 柱 頭 塌陷修 復辦 法 ? 擰下柱頭螺帽 (最好在臺虎鉗上 ) ? 用尖針輕輕除掉柱頭表面的污染填料 ? 取少量與色譜柱相同的新填料 ,調成漿糊狀(正相用正己烷 ,反相用甲醇 ) ? 填實柱頭 (輕輕下壓 ) ? 更換柱頭過濾板 ,將柱頭螺帽擰緊 液相色譜柱再生 反相色譜柱 用以下溶劑至少各 25mL沖洗色譜柱 (分析柱 ) ? 不含緩沖鹽的流動相 ? 100%甲醇 ? 100%乙腈 ? 75%乙腈 +25%異丙醇 ? 100%異丙醇 ? 100%二氯甲烷 ? 100%正己烷 ? 100%異丙醇 ? 100%甲醇 沖洗色譜柱要用比流動相更強的溶劑 液相色譜柱再生 ? 正相色譜柱 ? 用以下溶劑至少各 50mL沖洗色譜柱 (分析柱 ) ? 50%甲醇 +50%三氯甲烷 ? 100%乙酸乙酯 LOGO LiXiaoKua