【正文】 相模式 ：硅膠 、氧化鋁、聚苯乙烯等（封端技術(shù)） 2. 鍵合相 ： C C C1苯基、氨基等 ： 60100A 分子量 2021 300A 分子量 2021 ： 2um10um ： 10mm以下（分析）， 10mm以上（制備） ： 1 2 30mm 柱子的選擇 性能參數(shù) 正相 amp。如色譜柱通過流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰 1／ 4圈，直至不漏液為止。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管是外徑為 、內(nèi)徑為 。 （ 2）擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 常用的其他的反相填料還有鍵合 C C C NH苯基等。另一類正相填料是硅膠表面鍵合 — CN， NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。m的范圍內(nèi)。 色譜柱的構(gòu)造 柱填料： 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。空柱各組件均為不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上 (連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在 寸 )。 柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭兩端是螺紋組件連接，中間放置壓環(huán)用于密封。鈍化時(shí)使用HNO3在柱管內(nèi)至少滯留 10min，以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。 CMS軟件及時(shí)獲得結(jié)果 UltiMate 3000 RSLC 快速分離液相 18/06/2021 13 高性能－ UltiMate 3000 x2 三元梯度系統(tǒng) 有六通道脫氣機(jī)的溶劑架 獨(dú)特的雙梯度泵：兩個(gè)三元梯度泵封裝在一個(gè)機(jī)箱內(nèi) 帶溫控選項(xiàng)的自動(dòng)進(jìn)樣器 獨(dú)特的柱溫箱可放置兩個(gè)柱切換閥 可變波長或二極管矩陣紫外可見光檢測(cè)器 ? 與變色龍軟件結(jié)合，這是一臺(tái)真正獨(dú)一無二的快速的雙系統(tǒng)液相色譜 液相色譜柱的應(yīng)用 二、色譜柱的結(jié)構(gòu)和安裝 色譜柱的構(gòu)造 .色譜柱管 常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。 2 181。 樣品組分的分離 液相 色譜的基本流程圖 流動(dòng)相 泵 色 譜 柱 檢測(cè) 器 泵 輸 液 分離 檢測(cè) 記錄 A E G B C D F 進(jìn)樣閥 進(jìn)樣 ? HPG3x00RS 泵 – 在整個(gè)流速范圍下保持 800 bar高壓 – 最高流速達(dá)到 5 ml/min ? WPS3000RS 自動(dòng)進(jìn)樣器 – 進(jìn)樣周期 15 秒 – 進(jìn)樣閥耐壓 1000 bar ? TCC3000RS 柱溫箱 – 5110 176。 R值越大分離越好，反之則峰重疊愈多。u 色譜理論： 分離度 分離度：兩個(gè)相鄰組分的保留值之差與其平均峰寬之比。 ? ? 速率方程 H = A + B/u +C弟姆特于 1956年提出的 , 表述了影響柱效的因素及提高柱效的多種途徑，其核心是 速率方程 （也稱范 在實(shí)際工作中，常應(yīng)用另一表征色譜分配平衡過程的重要參數(shù) —— 容量因子 (capacity factor)，也稱分配比 (partition ratio)，以 k 表示。LOGO 液相色譜柱的應(yīng)用 主講人 : 李效寬 日 期 : Email: 色譜技術(shù) ： 19295477 高效液相色譜培訓(xùn)系列 目 錄 一、液相色譜分離原理 二、液相色譜柱的結(jié)構(gòu) 三、液相色譜柱的選擇 四、色譜柱的使用 五、 分析條件的影響 六、色譜柱的維護(hù) 一、 HPLC分 離原理 ? 樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分配，由于不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的交互作用能力 (吸附 .分配 .離子交換 .分子尺寸等 )不同，使得不同組分在色譜柱上的移動(dòng)速率不一樣，從而產(chǎn)生色譜分離。(必要條件 ) 分配 過 程 分配系數(shù) K K= K= 常數(shù) （ T恒定） Cm =組分在流動(dòng)相中的濃度 Cs = 組分在固定相中的濃度 CS Cm 容量因子 k 00tttk R ??是指在一定條件下，組分在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)的質(zhì)量比。 k = Ms / Mm Ms為組分在固定相中的質(zhì)量， Mm為組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量 由保留時(shí)間計(jì)算出容量因子，即可由實(shí)驗(yàn)測(cè)定容量因子 k 色譜理論： 塔板理論 柱分離效能指標(biāo) 色譜理論： 速率理論 影響柱效的因素 ? 速率理論是荷蘭學(xué)者范 弟姆特方程式）。u ? ? H： 理論塔板高度； ? u： 流動(dòng)相的線速度 色譜理論： 速率理論 影響柱效的因素 ? H = A + B/u +C R=2（ TR2TR1） /（ W2+W1） 計(jì)算表明： 1： R，兩組分不能完全分離 2： R=1時(shí)，兩組分峰重疊約 2% 3： R=，兩組分峰完全分離。 降低柱溫、增加柱長可使 R提高。 C 溫度范圍 – 柱后冷卻 ? DAD3000RS檢測(cè)器 – 全波長掃描范圍數(shù)據(jù)采集速率 100 Hz ? Acclaim174。m 色譜柱 – 耐壓 800 bar ?Chromeleon174。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用 50%的 HNO3對(duì)柱內(nèi)壁作鈍化處理。 色譜柱規(guī)格 內(nèi)徑：常用 ， ， 柱長：常用 50， 100， 150， 250cm 色譜柱的構(gòu)造 色譜柱管由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用到底，然后再擰緊空心螺釘。 色譜 柱子的 構(gòu)造 不同廠家和型號(hào)的柱 子會(huì)有一定的差別 液相色譜柱的構(gòu)造 在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片 (或?yàn)V網(wǎng) )，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。常用顆粒粒徑在 3— 10 181。 正相柱：多以硅膠為柱填料。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán) (ODS)的非極性填料。 液相色譜柱的安裝 色譜柱的安裝： （ 1）拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。 液相色譜柱的安裝 （ 3）按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接 (如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱 )；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰 1／ 41／ 2圈，切記不要用力過大。 連接接管必須注意： 如果伸出的管線長度過長，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差 死體積區(qū) 如果伸出的管線長度不夠，可能產(chǎn)生死體積 色譜連接注意事項(xiàng) 連接管線與接頭 HPLC中 HPLC中 ~ HPLC中 0. 5mm內(nèi)徑管線用于制備型 HPLC中 50 mL 柱外體積（管線） 4 3 2 1 Time (min) 10 mL 柱外體積 Time (min) 4 3 2 1 樣品 : 1. 苯丙胺酸 2. 5苯基 3, 6二氧 2哌嗪乙酸 3. AspPhe 4. 天冬甜素 色譜柱 : StableBond SBC18, x 30 mm, mm 流動(dòng)相 : 85% H2O with % 三氟乙酸 : 15% ACN 流速 : mL/min 溫度 : 35176。反相色譜 正相色譜 極性 :