【正文】 熱沖擊；O使用保護(hù)柱及在線過濾器；O經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；O充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；O用穩(wěn)定的固定相(C18最穩(wěn)定)：O在中等pH值操作時(6～8)，用有機(jī)緩沖溶液；O色譜柱使用溫度最好小于40℃；O硅膠基質(zhì)的色譜柱，～；O在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；O流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意用95：5的水及有機(jī)溶劑過濾，有機(jī)溶劑不能低于5％；O過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動相保存(乙腈最好)。過濾片選擇不好會改變色譜峰形，增加阻力或起不到阻擋污染物的作用(填料很快變色)。沖洗的程序在以下章節(jié)中介紹?？捎眉状?、乙腈沖反相柱，沖去留在柱上的強(qiáng)吸附組分。在這種情況下，應(yīng)立即中和樣品，或除去原溶劑中的有害成分。 有些樣品能很強(qiáng)地吸附在柱填料上，這樣會降低塔板數(shù)，改變樣品的保留物質(zhì)外，還要加保護(hù)柱，定期清洗色譜柱。如有沉淀要設(shè)法改變分離條件，包括換樣品溶劑和流動相或處理樣品去掉不溶物質(zhì)。 若懷疑樣品與流動相混合有沉淀而對色譜柱有阻塞，應(yīng)先試驗一下，看樣品溶液加入流動相中有無變渾或乳白色出現(xiàn)。有些樣品可能含有微粒物質(zhì)，樣品中的某種組分(如蛋白質(zhì))在柱頭上沉積下來，組分在固定相上保留很強(qiáng)，溶劑帶走柱填料等，這些都會造成柱效能下降或?qū)χ鶋勖挠绊?，有必要采取措施防止柱變壞。凝膠柱可存放在水溶性緩沖液中，％疊氮鈉以防止微生物的生長。 水溶性流動相會引起微生物生長而造成阻塞柱。另一方面，有些柱與某些溶劑(如四氫呋喃)一旦達(dá)到平衡，不要隨意改用其它溶劑。在40℃以上使用3μm柱，70℃以上使用5μm柱，會使值降低50％。 以硅膠為基質(zhì)的柱和陰離子交換柱超過60℃后，會增加對流動相中化學(xué)物質(zhì)的吸附。用預(yù)柱也有不利的影響，即新流動相難以平衡，保留時間不穩(wěn)定或穩(wěn)定慢。硅膠飽和了流動相，減少了分析柱填料的損失。如果一定要用高或低pH的流動相，可加預(yù)柱(飽和柱)。 ～7之間，極端pH的流動相能“溶解”硅膠，使鍵合相流失。柱切換技術(shù)的應(yīng)用也很廣泛，切換過程中在色譜柱的入口處壓力在零到很大數(shù)字之間變化，會很快使柱報廢。另外泵起動不應(yīng)過快，可分步操作。手動進(jìn)樣閥的變化不大，自動進(jìn)樣閥比較慢，可能造成壓力沖擊，可用氦氣代替空氣驅(qū)動進(jìn)樣閥。在閥的泵側(cè)壓力升高，在閥的柱側(cè)壓力降低(變化超過20％)。引起高壓突然沖擊，主要是因樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵起動快、柱切換操作等。自己填裝保護(hù)柱都是用短柱、不超過3cm長，內(nèi)徑2～3mm，用較大粒度的填粒(15～20μm)干法填裝，會使分析柱效略微有所降低。保護(hù)柱使用得當(dāng)，對分離無影響，好像未裝保護(hù)柱一樣。保護(hù)柱是消耗品，分析50～100個比較臟的樣品之后就要調(diào)換新的。保護(hù)柱的使命是收集阻塞柱進(jìn)口的來自樣品的化學(xué)“垃圾”。因為每個樣品都過濾既費事又帶來誤差，樣品量少過濾更困難，因此流路上裝過濾器是比較省事的辦法。加流路過濾器和保護(hù)柱 流路過濾器緊靠進(jìn)樣閥后面，位于分析柱前。影響柱壽命和其它問題的因素很多，而有些因素是操作者很難控制的，如果被分析的樣品(如分析生物樣品)，怎么凈化樣品也是“臟”的，對于色譜柱的影響是非常大的。評價一根色譜柱的主要指標(biāo)是：①塔板數(shù)N值；②峰不對稱因子As；③柱壓降；④鍵合相濃度。每一根新柱都應(yīng)標(biāo)出詳細(xì)參數(shù)，主要內(nèi)容包括公司名稱、柱名稱(商標(biāo))、柱填料、尺寸。 在實際工作中，選擇性能良好的柱可得到好的結(jié)果，首先要注意柱徑、長度、填料種類和填料粒度。顯然，聚合物柱要好一些，但目前仍是以硅膠基質(zhì)的柱為主。多孔聚合物微粒也適用于反相色譜。由于種種差異、僅能假設(shè)同一批號的柱有基本相同的性質(zhì)。不同的填料分析的效果可能不同，這是因為生產(chǎn)過程不同所致。制備型柱內(nèi)徑一般為8mm、25cm長。 不同液相色譜法的尺寸根據(jù)需要可以選取，普通分析3～30cm長，內(nèi)徑4～8mm。 色譜柱有不同的尺寸(長度和內(nèi)徑)，分制備型、常規(guī)分析型和微型。即不同類型的柱則代表了不同的色譜方法。色譜柱的價格昂貴，應(yīng)避免人為地?fù)p壞，并盡可能延長其壽命。 柱故障主要是由機(jī)械、色譜或者化學(xué)方面的原因引起的。發(fā)布日期：2007522第十一章 柱子的應(yīng)用與維護(hù) 色譜柱的液相色譜系統(tǒng)獲得分離的中心部件，許多分離問題都?xì)w結(jié)于色譜柱。轉(zhuǎn)載自：液相色譜培訓(xùn)講義(十)作者：對柱注意適當(dāng)?shù)木S護(hù)，則可緩解許多故障的發(fā)生。維護(hù)色譜柱和排除故障，；需要懂得液相色譜的分離過程以及色譜柱本身的構(gòu)造是非常重要的。一、色譜柱的種類與評價 一般地說，根據(jù)樣品的性質(zhì)決定采用何種液相色譜方法，然后再選擇不同類型的柱。 不同種類色譜柱的差異在于柱結(jié)構(gòu)、柱填料和柱尺寸的不同。不同類型柱的硬件也不同，(包括接頭、柱管等方面)，還有徑向加壓柱和夾套加熱柱等。常用20cm長、。微型柱內(nèi)徑l～3mm，長10～20cm。同一廠商生產(chǎn)的同種填料因批號不同也會有差異，這種差異可能從基質(zhì)就開始(表面積、雜質(zhì)、特殊處理)，還有鍵合的化學(xué)物質(zhì)(一氯或三氯硅烷反應(yīng)劑)，不同廠家生產(chǎn)的填料還會因?qū)＠夹g(shù)(預(yù)處理、鍵合過程、填裝技術(shù))等不同而呈現(xiàn)較大差異。 多數(shù)柱填料基質(zhì)采用多孔硅膠微粒，通常有球形和無定形兩種，具有不同的粒度、孔徑和表面積。聚合物柱的流動相范圍廣，流動相pH值可在1至13之間。原則上，聚合物柱可以克服硅膠基質(zhì)柱的某些不足，但需要大量的實驗來證實，要進(jìn)一步考查聚合物基質(zhì)填料的全面優(yōu)越性。 評價柱的好壞不僅只是N數(shù)，還應(yīng)考慮組分在柱上的保留、鍵合相表面的物性、柱壓降以及峰不對稱因子As等。附一張標(biāo)準(zhǔn)參考色譜圖，并標(biāo)出色譜條件、樣品名稱、流動相組成、流速、柱溫、進(jìn)樣體積、檢測器、峰的保留時間及峰名稱等。二、色譜柱預(yù)防性保護(hù)與柱壽命的延長 通常，一根色譜柱在分析數(shù)千個樣品之后性能仍然保持良好，但也有的柱僅分析不多的樣品后幾乎就報廢了。然而采取下列措施后，在多數(shù)情況下總能夠人為地減少柱上故障，達(dá)到延長壽命的目的。擋住來源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒入柱。也可以在流路加上保護(hù)柱，放在流路過濾器和分析柱之間，或者代替流路過濾器。這種垃圾最終降低柱效能。保護(hù)柱應(yīng)該是小體積，用分析柱的同種填料填裝。有些廠商的商品將保護(hù)柱和流路過濾器連在一個單元內(nèi)，使用起來非常方便。避免高壓沖擊 一般色譜柱都能經(jīng)得起高壓，但經(jīng)不起突然變化的高壓沖擊。轉(zhuǎn)動六通進(jìn)樣閥時從泵到柱的液流會瞬時切斷。閥轉(zhuǎn)到底后壓力突然沖擊一下恢復(fù)正常。因氮壓縮系數(shù)小。如用3mL／min流速，先從lmL／min到2mL／min，然后再3mL／min，每個間隔應(yīng)大于20s。分離條件 多數(shù)色譜柱有很寬的試驗條件范圍，但具體應(yīng)用又受到限制，主要是pH值、柱溫和流動相的選擇。結(jié)果非堿性組分的保留不斷減少，堿性組分的保留增加，引起堿性組分峰變寬。預(yù)柱裝在泵和進(jìn)樣閥之間，用分析柱相同的填料填裝，或者用普通硅膠。預(yù)柱不要求柱效高，用價格低的一般硅膠疏松地填裝，按期檢查硅膠的溶解情況。使用了預(yù)柱一定要加流路過濾器，以防止硅膠微粒引起的麻煩。在高溫下用小顆粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。 有些流動相中的溶劑不能用于某些柱，如小顆粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色譜。有關(guān)這些特殊填料，可以參見有關(guān)資料。色譜柱應(yīng)存放在純有機(jī)溶劑或加了50％有機(jī)溶劑的水中。凈化樣品 用溶劑溶解的樣品，多數(shù)組分在一定的時間內(nèi)能完全從柱中流出來，不會造成危害。 如在光線照射下觀察樣品是渾濁的或帶有乳白色，進(jìn)樣前必須要過濾．雖然流路上裝有過濾器和保護(hù)柱，但不能代替樣品的前處理，樣品中過多的微粒會使過濾器和保護(hù)柱超載，很快阻塞，或者微粒進(jìn)入分析柱，所以在進(jìn)樣前必須過濾樣品。如果進(jìn)樣后壓力突然增加而后又慢慢減小，表明樣品中有微粒或發(fā)生沉淀。應(yīng)盡量用小體積的樣品。有時因為疏忽，用對柱有害的溶劑溶解樣品，比如用6mol／L的氫氧化鈉溶解樣品，這樣的樣品只要進(jìn)50～100μL到硅膠基質(zhì)柱中，硅膠就很快溶解而使柱報廢。用強(qiáng)溶劑定期沖洗柱 每次工作結(jié)束，用強(qiáng)溶劑沖洗柱是良好的習(xí)慣。用甲醇水為流動相時也應(yīng)沖洗。柱頭的燒結(jié)不銹鋼濾片，要求平整，死體積小，孔徑適當(dāng)(2～5μm)。 此外，對柱硬件的保養(yǎng)也不可忽視．實際操作中應(yīng)注意以下幾點：①接頭要配套，用同一廠商的組接件；②接頭之間、柱壓帽螺母與密封卡套之間無微粒(填料)，否則收緊時容易咬死；③密封卡套與柱管一次性卡緊后再也不能松動，所以拆開柱頭再上緊時要小心，不能使卡套移動，原來柱端的不銹鋼濾片和墊片的厚度和強(qiáng)度也不能改變(改變這些附件的性能就促使卡套移動；④接頭等組接件不要擰得過緊，適當(dāng)上緊后接上泵試驗，分步擰緊，直到不漏為止．還有非常重要的是柱硬件的損壞往往會造成不可挽回的損失。三、怎樣選擇色譜柱 現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。（1）正相色譜 正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica) 以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH2APS)和氰基團(tuán)(CN,CPS)的鍵合相填料。 正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低 ，如：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。反相色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(butyl)、C6H5(Phenyl)等。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。 其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。如，石墨化碳正逐漸成為反相色譜柱填料。該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。氧化鋁也用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在pH高達(dá)12的流動相中使用。新型氧化鋯基質(zhì)色譜填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用pH范圍1~14，溫度可達(dá)100℃。四、怎樣選擇填料粒度 目前，商品化的色譜填料粒度從1μm到超過30μm均有售，而目前分析分離主要用5和10μm填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。3μm填料填充柱的柱效比相同條件下的5μm填料的的柱效提高近30％；然而，3μm的色譜柱的背壓卻是5μm的2倍。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。BμtylC4(CH3)3√√分離肚和蛋白質(zhì)，保留時間比C8和C18短。ODSC18C8H37√√烷基鍵合相中對中等極性化合物保留最強(qiáng)。CPSCN,Cyano(Propyl nitrile)(CH2)3CN√√對極性化合物有獨特的選擇性，適合應(yīng)用于正相分離。在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)用廣泛。弱陰離子交換，陰離子和有機(jī)酸則應(yīng)用緩沖劑和有機(jī)改性劑做流動相。Phenyl(CH3) C3H5√√芳香族化合物Diol(CH2)2OCH2(CH2OH)2√√反相時，分離肽和蛋白質(zhì)。通常，在選擇保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。保護(hù)柱越長，自然所裝填的色譜填料越多，則其越能避免污染物進(jìn)入分析色譜柱的機(jī)會。一般來說，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過程很簡單方便，而且可以在實驗室中進(jìn)行干裝。另外，薄膜裝填法的保擴(kuò)性所裝填的色譜填料有限，只能提供很有限的保護(hù)作用；不過也因為所裝填的色譜填料較少，保護(hù)柱的長度也較短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。整體式設(shè)計是由色譜柱的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。另外從保護(hù)柱結(jié)構(gòu)的角度看，保護(hù)柱的結(jié)構(gòu)又分為是否可以更換保護(hù)柱柱芯。大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料選擇保護(hù)柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。 對于選擇保護(hù)柱的原則是：在滿足分析分離要求的前提條件下，盡可能地選擇較短的保護(hù)柱結(jié)構(gòu)，盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。當(dāng)然誰也不能保護(hù)色譜柱“永遠(yuǎn)”不出故障，任何一根色譜柱最終都會因為柱效下降直到報廢。有時往往是幾種情況伴隨著同時發(fā)生。這兩種情況的差別之所以這么大，關(guān)鍵在于處理樣品的方法不同。N值突然下降(如一個工作日內(nèi))，應(yīng)考慮柱頭塌陷或進(jìn)了不合格的樣品。新建立的方法中柱效下降，可能是樣品和其它內(nèi)在因素引起，此時要采取相應(yīng)措施，防止繼續(xù)給柱造成危害。峰形變壞而保留時間不變，多半是柱受到阻塞(不銹鋼燒結(jié)片)，或者柱頭有了空穴。如果壓力一下子增加過高，應(yīng)考慮兩種可能，一是樣品沉積在柱內(nèi)，二是柱內(nèi)硬件阻塞(未考慮系統(tǒng)其它部分的阻塞)。沖洗時拆開柱與檢測器之間接頭，正向沖洗或?qū)⒅隹诮釉诒蒙戏聪驔_洗(如果柱條件許可)，使用大約30～50mL溶劑。在沖洗過程中不斷檢查，直到壓力恢復(fù)正常為止。換濾片時盡量不要攪動柱頭填料，如有塌陷，可用同種填料中乙醇調(diào)成糊狀補(bǔ)平柱頭，壓緊，壓平，柱性能可恢復(fù)如前。保留時間的改變 保留時間的變化指兩種類型的情況，第一種是同一根柱樣品間的保留變化，第二種類型主要是填料的差異造成的，許多實驗都會碰到，現(xiàn)討論如下。如果譜圖中色譜順序發(fā)生了變化，或者兩峰重疊在一起，問題就比較嚴(yán)重。硅膠為基質(zhì)的填料表面含有硅醇，有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅膠表面硅醇基更多。硅酸與樣品分子作用的強(qiáng)弱，因不同批號的硅膠和不鍵合相填料而異。硅醇對陽離子或堿性樣品影響最大。 (1)僅用同一廠商的柱。 (2)設(shè)計分離條件，使保留值變化最小(建立標(biāo)準(zhǔn)的方法)。 (4)換新柱時調(diào)整分析條件保持舊柱的保留值(改變條件)。