【正文】 min x 150 mL 15 min x 50 mL 5 min 60 sec x 30 mL 3 min 36 sec x 15 mL min 18 sec 色譜柱尺寸 柱內體積 平衡時間 流速 (mm) (Vm) mL/min 色譜柱尺寸 柱內體積 平衡時間 流速 (mm) (Vm) mL/min mL/min 單次樣品運行時間 = 分析時間 + 色譜柱平衡時間 色譜柱平衡時間 = 10倍柱內體積 247。 試劑純度：采用 “ HPLC ”級溶劑 對試樣有適宜的溶解度 溶劑前處理 ? 脫氣 目的：除去流動相中溶解或因混合而產生的 氣泡 氣泡對測定的影響： 1）柱流量不準 2）檢測器基線波動 返回 基線問題分析 液相色譜柱的使用 平衡色譜柱 ? 反相色譜柱在經過出廠測試后是保存在甲醇 （ 乙腈 ） 的 。硅膠小孔難到達。 全多孔色譜柱 ? 可用于分離蛋白質和多肽 色譜柱填料孔徑必須適合待測物分子自由進出填料孔 , 與孔內表面的鍵合相進行分離分配 300197。m 5 181。 硅膠純度 A類硅膠 由于帶負電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高 (硅羥基的 pKa低 ), 導致堿性化合物發(fā)生拖尾 B類硅膠 (高純 ) 由于金屬含量低 , 硅羥基 pKa高 , 堿性化合物不易發(fā)生拖尾 ？？一般金屬濃度 35 ppm)。在接管時一定要設法降低柱外死體積。另一類正相填料是硅膠表面鍵合 — CN， NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上 (連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應嚴格控制在 寸 )。 2 181。 ? ? 速率方程 H = A + B/u +C(必要條件 ) 分配 過 程 分配系數 K K= K= 常數 （ T恒定） Cm =組分在流動相中的濃度 Cs = 組分在固定相中的濃度 CS Cm 容量因子 k 00tttk R ??是指在一定條件下，組分在兩相間達到分配平衡時的質量比。 R=2（ TR2TR1） /（ W2+W1） 計算表明： 1： R，兩組分不能完全分離 2： R=1時，兩組分峰重疊約 2% 3： R=，兩組分峰完全分離。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用 50%的 HNO3對柱內壁作鈍化處理。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。 液相色譜柱的安裝 色譜柱的安裝： （ 1）拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。 連接接管必須注意： 如果伸出的管線長度過長，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差 死體積區(qū) 如果伸出的管線長度不夠，可能產生死體積 色譜連接注意事項 連接管線與接頭 HPLC中 HPLC中 ~ HPLC中 0. 5mm內徑管線用于制備型 HPLC中 50 mL 柱外體積（管線） 4 3 2 1 Time (min) 10 mL 柱外體積 Time (min) 4 3 2 1 樣品 : 1. 苯丙胺酸 2. 5苯基 3, 6二氧 2哌嗪乙酸 3. AspPhe 4. 天冬甜素 色譜柱 : StableBond SBC18, x 30 mm, mm 流動相 : 85% H2O with % 三氟乙酸 : 15% ACN 流速 : mL/min 溫度 : 35176。 色譜柱子的尺寸 色譜柱尺寸 對色譜分離的影響： ? 短柱 (15100mm) 運行時間短 , 柱壓低 ? 長柱 (150250mm) –運行時間長，分離度高 ? 窄徑柱 (? ) 檢測器靈敏度高 ? 寬徑柱 (323mm) 載樣量高 顆粒形狀與大小 顆粒形狀： 1 球形 2 無定形 球形 粒徑 對色譜分離的影響 較小的顆粒柱效較高 , 但會引起柱壓過高 . , 而組份單一的樣品多采用 5181。242nm,甲醇 15%→60%(45min) C18 *150,。) PW 1/2 孔徑 , 分子量對峰寬的影響 (梯度分離 ) 選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳峰形 300197。 封端技術比較 保留值與 pH的關系 pH變化值 RS變化值 色譜柱： Zorbax StableBond C18 X 250mm, 5um 部件號： 880975906 流動相： 27%甲醇： 73%磷酸 pH amp。 如果需要使用含水的流動相 ， 使用流動相之前用異丙醇過渡 。對內徑為 ，流速一般選擇 1ml／ min，對于內徑為 ，流速 ／ min為佳。 10% ? 流動相 PH： 177。 C USP Tf 10 mM 磷酸鹽 pH USP Tf 25 mM 磷酸鹽 pH ? 在中等 pH下 , 離子強度較高 , 能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾 隨緩沖鹽濃度 升高， Rt降低 流動相 pH值的選擇 ? 酸性分析物： pH≤pKa ? 單一堿性分析物： pH≤ 或 pH≥pKa+2 ? 復雜堿性混合物： pH≥pKa+2 反相 HPLC常用緩沖液 緩沖液 pKa pH范圍 磷酸鹽 pK1 ~ 檸檬酸鹽 pK1 ~ 甲酸鹽 ~ 檸檬酸鹽 pK2 ~ 乙酸鹽 ~ 檸檬酸鹽 pK3 ~ 磷酸鹽 pK2 ~ 羥甲基甲胺 ~ 氨 ~ 硼酸鹽 ~ 甘氨酸 ~ 1甲基 哌啶 ~ 四氫化吡咯 ~ 二乙胺 ~ 三乙胺 ~ 磷酸鹽 pK3 ~ 緩沖液的一般 有效緩沖范圍 為 PK177。 ? ?? 定期用合適的流動相清洗保存的柱子，避免干涸。m UV: 254 nm 流速 : 1 mL/ min. te 甲酸酯 刻度混合 : 比例閥 A: 水 B: 甲醇 , 用泵抽取 50% B 體積比混合 : V/V 250 mL水 + 250 mL甲醇 , 用泵抽取 100%混合液 定容混合 : 250