【正文】 鍵合相的反相模式 抑制電離反相鍵合相色譜 用硅膠的正相模式 離子交換模式 凝膠滲透色譜 凝膠過濾色譜 大孔填料的離子交換模式 用大孔填料的反相模式 分子量 2021 分子量 2021 低分子凝膠滲透色 用硅膠的正相模式 用鍵合相的正相模式 ：硅膠 、氧化鋁、聚苯乙烯等（封端技術(shù)） 2. 鍵合相 ： C C C1苯基、氨基等 ： 60100A 分子量 2021 300A 分子量 2021 ： 2um10um ： 10mm以下（分析）， 10mm以上（制備） ： 1 2 30mm 柱子的選擇 性能參數(shù) 正相 amp。反相色譜 正相色譜 極性 :固定相 流動相 固定相 極性 流動 相 (正己烷 , 異丙醇 ) 非極性 極性物質(zhì)后出峰 反相色譜 極性 :固定相 流動相 固定相 非極性 流動相 (甲醇 , 乙腈 , THF,) 極性 非極性物質(zhì)后出峰 正相色譜 C B A B A C B A C B A ? 低極性流動相 ? 中極性流動相 極性 :ABC 反向色譜法 ? 固定相（非極性） C18 , C8 , C4 , 苯基 ? 流動相 (極性 ) Water,MeOH,MeCN,THF ?Type of Compounds:中性，弱酸，弱堿 溶劑極性 各種反相填料的使用比例 C 1 8P h e n y lC4C8其他 C 1 8P h e n y lC4C8其他反向色譜法 ? 高極性流動相 ? 中極性流動相 極性 :ABC A B C A B C 流動相 1. 反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下： H2O＜ 甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃 最常用的流動相組成是：“甲醇 — H2O”和“乙腈— H2O”， 由于乙腈的毒性大，價格貴，通常優(yōu)先考慮“甲醇 — H2O”流動相。 2. 正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇 最常用的是 正已烷 ， 不同混合溶劑的粘度比較 柱填料基質(zhì) ? 硅膠基質(zhì) pH 2~8 ? Al2O3 . nH2O pH1~14 ? 聚合物基質(zhì) pH1~14 高或低 pH下 , 硅膠會溶解 化學修飾困難 孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜 , 孔徑不均勻，導致柱效不夠高 , 有機溶劑可能導致聚合物基質(zhì)溶漲而受損 色譜柱的性能參數(shù) 物理性質(zhì) ?硅膠純度 ?色譜柱尺寸 ?顆粒形狀 ?粒徑 ?表面積 ?孔徑 ?鍵合類型 ?碳覆蓋率 ?封端 化學性質(zhì) 色譜柱的物理性質(zhì) 硅膠純度 填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度 色譜柱尺寸 色譜柱子的長度和內(nèi)徑 顆粒形狀 球型或不規(guī)則型 粒徑 平均顆粒直徑 , 通常 310181。m 表面積 顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和 , 以 m2/g表示 孔徑 顆粒的孔或腔的平均尺寸 , 范圍 80300197。 硅膠純度 A類硅膠 由于帶負電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高 (硅羥基的 pKa低 ), 導致堿性化合物發(fā)生拖尾 B類硅膠 (高純 ) 由于金屬含量低 , 硅羥基 pKa高 , 堿性化合物不易發(fā)生拖尾 ？？一般金屬濃度 35 ppm)。 % 純度的二氧化硅 A型、 B型硅膠比較 A型硅膠 化合物 被吸收 B型硅膠 峰型峰高 分離正常 金屬敏感測試 ? 色譜柱 Diamonsil（鉆石）C18 ? 5um， 150 x ? 流動相 CH3CN / Water (50:50) ? 流速 mL/min ? 檢測 UV@230nm ? 硅膠中如果存在金屬雜質(zhì)，將與 2,3 二羥基萘（峰 2）形成金屬螯合物，保留時間延長并導致峰形拖尾。 2,7 二羥基萘（峰 1）不與金屬作用并作為內(nèi)標物。 色譜柱子的尺寸 色譜柱尺寸 對色譜分離的影響： ? 短柱 (15100mm) 運行時間短 , 柱壓低 ? 長柱 (150250mm) –運行時間長，分離度高 ? 窄徑柱 (? ) 檢測器靈敏度高 ? 寬徑柱 (323mm) 載樣量高 顆粒形狀與大小 顆粒形狀： 1 球形 2 無定形 球形 粒徑 對色譜分離的影響 較小的顆粒柱效較高 , 但會引起柱壓過高 . , 而組份單一的樣品多采用 5181。m的粒徑 5181。m 7181。m 10181。m 填料粒度 ? 商品化的填料從 1μ m ~30μ m ? 目前常用于分析 3μ m ,5μ m ,10μ m ? 用于半制備 10μ m ,15μ m ? 用于制備 15μ m ~40μ m 3 μ m 填料 粒徑的影響 N Flow 3 181。m 5 181。m 10 181。m 粒徑與柱效 流速設(shè)定 色譜柱尺寸和填料 粒徑的影響 C18 *250,5um。242nm,甲醇 15%→60%(45min) C18 *150,。242nm,甲醇 15%→ 60%(25min) C18 *50,。242nm,甲醇 15%→60%(10min) 比表面積與孔徑 表面積 對色譜分離的影響 高比表面積對于多組份樣品的分離具有較強的保留能力、柱容量和分離度 . 比表面積低的填料通常能迅速達到平衡狀態(tài) , 對于梯度淋洗尤為重要 孔徑 對色譜分離的影響 大孔的填料顆?？梢匝娱L溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時間 , 達到充分分離 , 改善峰形 樣品 MW ? 2, 000, 選擇 100197。 的孔徑 樣品 MW 2, 000, 選擇 300197。 的孔徑 比表面積的比較 比表面積與孔徑的影響 大孔徑填料適用于大分子分析 ? 大孔徑 300197。 全多孔色譜柱 ? 可用于分離蛋白質(zhì)和多肽 色譜柱填料孔徑必須適合待測物分子自由進出填料孔 , 與孔內(nèi)表面的鍵合相進行分離分配 300197。 孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形 0 300SBC18 (300197。) SBC18 (80197。) PW 1/2 孔徑 , 分子量對峰寬的影響 (梯度分離 ) 選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳峰形 300197。 孔徑可改善大分子的峰形 色譜柱 : x 150 mm, 5 mm 流動相 : 60% MeOH: 40% % 三氟乙酸 流速 : mL/min 溫度 : RT 檢測器 : UV 282 nm ? 溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑 ? 窄的峰寬表明待測分子進入填料孔沒有受到阻礙 SBC3 (80197。) 300SBC3 (300197。) Pw 1/2 = Pw 1/2 = O O N HO HO CHO HO O H O H O O O O O O O CH 3 CH 3 OCH 3 OCH 3 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C H 3 C H 3 C 0