【正文】 一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強(qiáng)度、極性、 pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。 梯度洗脫裝置分為 兩類 ： 一類是 外梯度裝置 （又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺泵即可。 另一類是 內(nèi)梯度裝置 （又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。 梯度洗脫的實質(zhì) 是通過不斷地變化流動相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的 k值，使所有譜帶都以最佳平均 k值通過色譜柱。 它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫 。所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì) k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、 pH值和離子強(qiáng)度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到 。 在線脫氣裝置 在線脫氣裝置用于脫去流動相中的溶解氣體，流動相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。 除在線脫氣裝置外，目前也采用超聲脫氣、真空脫氣等方式。 脫氣不好時有氣泡，導(dǎo)致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。 在高效液相色譜中 , 速率方程中的分子擴(kuò)散項 B/U較小 ， 可以忽略不計 ， 而只有兩項 ， 即： H = A + C u 故液相色譜 Hu曲線與氣相色譜的形狀不同 ， 如圖所示： 影響分離的主要因素 有流動相的流量、性質(zhì)和極性。 三、影響分離的因素 流速： 流速大于 cm/s時 , H～ u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。 影響分離的因素 固定相及分離柱 ：氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備 。 高效液相色譜的固定相和流動相 （－）固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為 剛性固體和硬膠 兩大類。剛性固體以 二氧化硅為基質(zhì) ，可承受 108～ 109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。 硬膠 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由 聚苯乙烯 與二乙烯苯基 交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓? 108Pa。 固定相按孔隙深度分類，可分為 表面多孔型 和 全多孔型固定相 兩類。 它的 基體 是實心 玻璃珠 ，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。 表面活性材料 為 氧化鋁 的固定相，這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。 2．全多孔型固定相 它由 直徑為 10nm的硅膠微粒凝聚 而成。也可由 氧化鋁微粒凝聚 成全多孔型固定相， 這類固定相由于顆粒很細(xì)（ 5～ 10μm）， 孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。 ?流動相及流動相的極性 （ 1） 可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要 。 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液 ， 洗脫劑 。 （ 2） 親水性固定液常采用疏水性流動相， 即流動相的極性小于固定相的極性 ， 稱為 正相液液色譜法 ， 極性柱也稱 正相柱 。 （ 3） 若流動相的極性大于固定液的極性 ， 則稱為 反相液液色譜 ， 非極性柱也稱為 反相柱 。 組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反 。 ?流動相組成 流動相按組成不同可分為 單組分和多組分； 按極性可分為 極性 、 弱極性 、 非極性； 按使用方式有 固定組成淋洗和梯度淋洗 。 常用溶劑 : 烷 、 四氯化碳 、 甲苯 、 乙酸乙酯、 乙醇 、 乙腈 、 水 。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性 ， 以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間 。 （二）流動相 由于高效液相色譜中流動相是液體 ，它對組分有親和力 ， 并參與固定相對組分的競爭 。 因此 ， 正確選擇流動相直接影響組分的分離度 。 對流動相溶劑的要求是： （ 1） 溶劑對于待測樣品 ， 必須具有合適的極性和良好的選擇性 。 （ 2） 溶劑要與檢測器匹配 。 2021/6/15 （ 3） 高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加 50～ 1OOnm。 （ 4） 化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。 （ 5） 低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。 對于紫外吸收檢測器，應(yīng) 注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長 。 所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。表 202列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)最高靈敏度。 高效液相色譜法的主要分離類型 （ 液 固吸附色譜 ） ：以固體吸附劑為固定相 ， 如硅膠 、 氧化鋁等 ， 較常使用的是 5～ 10μ m的硅膠吸附劑 。 流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑 。 （ 液 液分配色譜 ） ：早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相 , 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相 ， 即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面 。 ：固定相為離子交換樹脂， 流動相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的水溶液 。 各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離 。 （ 空間排阻色譜 ） ：以凝膠為固定相 。 凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的 、 具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱 。如葡聚糖凝膠 、 瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠 、 聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠； 高效液相色譜法的 主要類型及選擇 （ － ） 液一液分配色譜法 （ LLPC） 在液 液色譜中 ,流動相和固定相都是液體 ,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。 液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是 根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。 所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 由于液液色譜中流動相參與選擇競爭 ， 因此 ， 對固定相選擇較簡單 。 只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題 。 例如 ， 最常用的 強(qiáng)極性 固定液 β， β′一氧二丙睛 ， 中等極性 的聚乙二醇 ， 非極性 的角鯊?fù)榈?。 在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且 流動相與固定相的極性差別越顯著越好 。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為 正相分配色譜和反相分配色譜 。 如果采用 流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜 ，它適用于極性化合物的分離。其 流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出 。 如果采用 流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜 。它適用于非極性化合物的分離， 其流出順序與正相色譜恰好相反 。 為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了 化學(xué)鍵合固定相 。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用， 可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破 。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有 3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。 （二）化學(xué)鍵合相色譜法（ CBPC） 采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法 ， 簡稱鍵合相色譜 。 由于鍵合固定相非常穩(wěn)定 ， 在使用中不易流失 ， 適用于梯度淋洗 ， 特別適用于 分離容量因子 k值范圍寬 的樣品 。 由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的 ， 因此它適用于種類繁多樣品的分離 。 用來制備鍵合固定相的載體 ， 幾乎都用 硅膠 。 利用硅膠表面的硅醇基 (Si一 OH)與有機(jī)分可成鍵 ,即可得到各種性能的固定相 。 一般可分 三類 （ 1） 疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴 （ C8和 C18） 和苯基等； （ 2） 極性基團(tuán) 如氨丙基 ， 氰乙基 、 醚和醇等； （ 3） 離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基 ， 季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等 。 （ l） 硅酸酯 （ ≡Si一 OR） 鍵合固定相 ,它是最先用于液相色譜的健合固定相 。 用醇與硅醇基發(fā)生酯化反