【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 應(yīng)： ≡Si－ 0H＋ ROH→≡Si － OR＋ H20 由于這類(lèi)鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體 ， 具有良好的傳質(zhì)特性 ,但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定 ， 因此 僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相 。 （ 2） ≡Si－ C或 Si一 N共價(jià)鍵合固定相 制備反應(yīng)如下： O HS i S O C l2C lS i+H g B rS iS i N H C H 2 C H N H 2H2 NCH2 CH2 NH2 共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)， 必須限制 pH在 4～ 8范圍內(nèi)。 （ 3） 硅烷化 （ ≡Si— O－ Si－ C） 鍵合固定相 制備反應(yīng)如下： O HS i C l S i R 3+ S i O( R O S i R 3 )S i R 3 + H C l 這類(lèi)鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在 70℃ 以下，pH=2～ 8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。 3．反相鍵合相色譜法 此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相 ， 如 硅膠一 C18H3 硅膠一苯基等； 流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑 ， 如甲醇 、 乙睛一水 、 水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液 等 。 它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物； 若采用 含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動(dòng)相 ， 也可用于分離極性化合物； 若采用 水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相 ， 則可分離一些易離解的樣品 ， 如有機(jī)酸 、 有機(jī)堿 、 酚類(lèi)等 。 反相鍵合相色譜法具有柱效高 ， 能獲得無(wú)拖尾色譜峰的 優(yōu)點(diǎn) 。 關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理 ， 可用所謂 疏溶劑作用理論來(lái)解釋 。 這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的 “ 分子毛 ” ， 這種“ 分子毛 ” 有較強(qiáng)的疏水特性 。 當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)： 一方面 ， 分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用 ， 使它保留在固定相中； 而 另一方面 ， 被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用 ， 促使它離開(kāi)固定相 ，并減小其保留作用 （ 見(jiàn)圖 204） 。 顯然 ，兩種作用力之差 ， 決定了分子在色譜中的保留行為 。 此法是 以極性的有機(jī)基團(tuán) ， CN、NH2。 雙羥基等鍵合在硅膠表面 ， 作為固定相 ；而以非極性或極性小的溶劑 （ 如烴類(lèi) ） 中加入適量的極性溶劑 （ 如氯仿 、 醇 、乙腈等 ） 為流動(dòng)相 ， 分離極性化合物 。 此時(shí) ， 組分的分配比 k值隨其極性的增加而增大 ， 但隨流動(dòng)相極性的增加而降低 。 這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體 、極性不同的化合物 ， 特別適用于分離不同類(lèi)型的化合物 。 當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì) ， 化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán) ，如一 SO3H 一 CH2NH － C00H、 一CH2N（ CH3） 等時(shí) ， 就形成了離子性鍵合相色譜的固定相； 流動(dòng)相一般采用緩沖溶液 。 其分離原理與離子交換色譜類(lèi)同 。 以上討論了各種類(lèi)型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的 最大優(yōu)點(diǎn) 是： 通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類(lèi)，可有效地分離各種類(lèi)型化合物（非極性、極性和離子型） 。 此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有 8O％ 的分離問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決。 此法的最大 缺點(diǎn) 是不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系。 如何根據(jù)樣品極性種類(lèi)來(lái) 選擇化學(xué)鍵合的固定相 ，請(qǐng)參看表 213。 （三）液一固吸附色譜法 (LSAC) 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。 1． 分離原理 當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相 （ 吸附劑 ） 時(shí) ，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子 。 同時(shí) ， 當(dāng)試樣分子 （ X） 被流動(dòng)相帶入柱內(nèi) ， 只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分用 ） 于是 ， 在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附 : X + nSad = Xad + nS 達(dá)平衡時(shí) ,有 nadnadadSXSXK]][[]][[?其中 Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。 Kad值小 ,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。 Kad值可通過(guò)吸附等溫線(xiàn)數(shù)據(jù)求出。 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑 ， 如 硅膠 、 氧化鋁 、聚酸膠等 。 由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多 ， 如線(xiàn)性容量較高 ， 機(jī)械性能好 ， 不溶脹 ， 與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等 ， 因此 ， 以硅膠用得最多 。 在高效液相色譜法中 ， 表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相 ，它們具有填料均勻 、 粒度小 。 孔穴淺的優(yōu)點(diǎn) ， 能極大地提高柱效 。 但表面多孔型由于試樣容量較小 ， 目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料 。 3 流動(dòng)相 一般把吸附色譜中 流動(dòng)相稱(chēng)作洗脫劑 。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ ε0） 來(lái)衡量， ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。 下表列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中 ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ ε0硅膠 = ε0氧化鋁）。 液固色譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等相對(duì)分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。 特別適用于分離異構(gòu)體。 (四）離子交換色譜法（ IEC） 此法是利用 離子交換原理和液相色譜技術(shù) 的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。 凡在 溶液中 能夠電離的物質(zhì)， 通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離 。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 1． 離子交換原理 離子交換色譜法是利用不同 待測(cè)離子 對(duì)固定相 親和力的差別 來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的 。 其固定相采用 離子交換樹(shù)脂 ， 樹(shù)脂上分布有 固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子 。 R S O 3 H + + M + R S O 3 M + + H +R N R 3 + C l + X R N R 3 + X + C l 陽(yáng)離子交換 ： 當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換， 其交換反應(yīng)通式如下： 一般形式： R一 A＋ B ＝ R－ B＋ A 達(dá) 平衡 時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)） ： rrAB ABABK]][[][][/ ? 式中 [A]r， [B]r 分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（ A） 和試樣離子（ B） 的濃度， [A]、 [B]則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛取? 離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)表示試樣離子 B對(duì)于 A型樹(shù)脂親和力的大?。?KB/A越大，說(shuō)明 B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。 一般說(shuō)來(lái)， B離子電荷越大，水合離子半徑越小， KB/A值就越大。 對(duì)于典型的 磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 ， 一價(jià)離子的 KB/A值按以下順序： Cs+＞ Rb+＞ K+＞ NH4+＞ Na+＞ H+＞ Li+ 二價(jià)離子的順序?yàn)椋? Ba2+＞ Pb2+＞ Sr2+＞ Ca2+＞ Cd2+＞ Cu2+， Zn2+＞ Mg2+ 對(duì)于季銨型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋? ClO4＞ I＞ HS04＞ SCN＞ NO2＞ Br＞ CN＞ Cl＞ BrO3＞ OH＞ HCO3＞ H2P04＞IO3＞ CH3COO－ ＞ F－ 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類(lèi)： 合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠 。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）。 常用的離子交換劑固定相大致可分以下 幾種： （ l） 多孔型離子交換樹(shù)脂 它主要是 聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物 ， 直徑約為 5～ 20μm， 有微孔型和大孔型之分； （ 2） 薄膜型離子交換樹(shù)脂 它是在直徑約為 30μm的固體惰性核上，凝聚 1～ 2μm厚的樹(shù)脂層； （ 3） 表面多孔型離子交換樹(shù)脂 它是在固體惰性核上 ， 覆蓋一層微球硅膠 ， 再在上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂； （ 4）離子交換鍵合固定相 它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為 兩種類(lèi)型 ： 一種是 鍵合薄殼型 ，其載體是薄殼玻珠。另一種是 鍵合微粒載體型 ，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn) 是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分離。 3．流動(dòng)相 離子交換色譜法所用流動(dòng)相 大都是一定pH和鹽濃